多菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕的工藝研究
豆粕是大豆經(jīng)提取豆油后得到的副產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)成分齊全且均衡。發(fā)酵豆粕是通過微生物發(fā)酵，去除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)性能和使用價(jià)值，擴(kuò)大豆粕的使用范圍。
目前對(duì)豆粕固態(tài)發(fā)酵較多的研究了單菌發(fā)酵和兩種細(xì)菌混合發(fā)酵。吳定等研究了少孢根霉RT-3制備菌絲碎片發(fā)酵劑，固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)飼料，提高了發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)消化率；劉喚明等研究了由枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵豆粕的發(fā)酵工藝，提高了發(fā)酵豆粕的水解度；季偉等利用產(chǎn)Nisin 的乳酸鏈球菌WX506固態(tài)發(fā)酵豆粕，使發(fā)酵粕的生物量達(dá)到1.03g/kg ，Nisiin效價(jià)達(dá)到997 IU/g ；原海兵等采用黑曲霉和米曲霉復(fù)合菌株固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)豆粕飼料，研究了發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響，得到了最佳工藝條件；王哲奇等采用枯草芽孢桿菌和米曲霉混合固態(tài)發(fā)酵豆粕，研究發(fā)酵產(chǎn)物中多肽的含量；尹慧君等采用不同種微生物，在適宜條件下對(duì)豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，有效的消除或降低了豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。本試驗(yàn)參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，選擇可溶性蛋白質(zhì)和大豆球蛋白為指標(biāo)，考核豆粕發(fā)酵后可利用蛋白質(zhì)的增加量和抗?fàn)I養(yǎng)蛋白的減少量。采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕，以彌補(bǔ)單菌發(fā)酵的不足，更好的提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)和降低生長(zhǎng)抑制因子；優(yōu)化工藝條件，為發(fā)酵豆粕的應(yīng)用提供參考。
1.1 材料 豆粕：益海嘉里公司購得，化學(xué)試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純。 菌種：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌。保存于吉林工商學(xué)院食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。菌種含量為1ⅹ 108 CFU/ml ，菌種比例為1：1：1 ，接種量15％ 。 設(shè)備：SKD‐2000型凱氏定氮儀，SPH2102C 型立式恒溫培養(yǎng)振蕩器，101-2 型干燥箱，SPX‐150B‐Z 型生化培養(yǎng)箱，YXQ .SG46-280S 型滅菌鍋，BCD‐271 海爾冰箱，SW‐CJ‐２FD 超凈工作臺(tái)。 1.2 方法 1.2.1 豆粕發(fā)酵工藝 采用張雁平等豆粕發(fā)酵工藝方法進(jìn)行研究。 1.2.2 可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定 按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19541-2004 獲得上清液，通過茚三酮比色法測(cè)定上清液中游離氨基的含量。 1.2.3 大豆球蛋白的測(cè)定 采用文獻(xiàn)中的酶聯(lián)免疫吸附方法進(jìn)行測(cè)定。 1.2.4 單因素試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，在pH7.2環(huán)境下，初步確定發(fā)酵時(shí)間6d 、發(fā)酵溫度40℃ 、初始水分40％ 、含糖量２％ 、外源酶（中、酸性蛋白酶）的添加量0.3％ 以及中、酸性蛋白酶的比例３：１ 等6個(gè)因素，以可溶性蛋白質(zhì)和大豆球蛋白為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。 1.2.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定對(duì)蛋白質(zhì)含量影響較大的４個(gè)因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵條件。 2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)的影響試驗(yàn)結(jié)果1材料與方法
2結(jié)果與分析
由圖１ 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性蛋白質(zhì)的曲線呈現(xiàn)急速上升、較為平緩、再明顯上升的趨勢(shì)。１ ～ ３ d上升明顯可能是在多種酶的作用下，大分子蛋白質(zhì)的降解速度較快，而酶量減少造成了３ ～ ５ d曲線的平緩，５ d 以后，可溶性蛋白質(zhì)急劇增多，說明在微生物的作用下，大分子蛋白質(zhì)開始全面降解；大豆球蛋白隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈下降趨勢(shì)，2 ～ 4 d是大豆球蛋白降解高峰期，4 d 以后，大豆球蛋白含量相對(duì)穩(wěn)定，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)大豆球蛋白影響不大，說明大豆蛋白已經(jīng)降解完畢。綜合可溶性蛋白質(zhì)和大豆球蛋白含量來看，發(fā)酵時(shí)間5 ～ 7 d 較為理想。
2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白質(zhì)的影響試驗(yàn)結(jié)果
由圖２ 可知，可溶性蛋白質(zhì)曲線呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢(shì)，30 ℃ ～ 55 ℃ 時(shí)變化幅度不大，蛋白質(zhì)含量在110 μmol/g 左右， 40 ℃ 時(shí)最高， 為128.3 μmol/g 。大豆球蛋白的曲線是先下降、后上升的趨勢(shì)，25 ～ 35℃ 時(shí)，下降明顯，45～ 55 ℃ 時(shí)，上升明顯，而35 ～ 45 ℃ 時(shí)，曲線相對(duì)平緩，說明溫度對(duì)大豆球蛋白含量的影響較大，綜合來看，35 ～ 45 ℃ 范圍內(nèi)，兩種蛋白質(zhì)含量較為理想。
2.1.3 初始水分對(duì)蛋白質(zhì)的影響試驗(yàn)結(jié)果
由圖３ 可知，隨著初始水分的增加，可溶性蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，水分在30％ ～ 60％ 時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量增加明顯，之后曲線平緩。說明可溶性蛋白質(zhì)含量與初始水分具有相關(guān)性，而水分達(dá)到一定值以后，水分的增加對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量影響不大，因?yàn)樗值脑黾哟龠M(jìn)水解酶的擴(kuò)散，造成發(fā)酵底物多孔性的降低。大豆球蛋白的含量前期呈驟然下降趨勢(shì)，水分達(dá)40％ 以后，大豆球蛋白的含量不再變化。綜合兩個(gè)因素，初始水分在40％ ～ 60％ 較為理想。
2.1.4 含糖量對(duì)蛋白質(zhì)的影響試驗(yàn)結(jié)果
由圖4 可知，在含糖量0.5％ ～ 2％ 時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量接近，都比未添加糖時(shí)明顯升高，說明糖對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量影響較大，但是糖的含量對(duì)可溶性蛋白質(zhì)影響不明顯。含糖量對(duì)大豆球蛋白的影響微乎其微，在糖含量2％ 時(shí)，大豆球蛋白含量最低，為15.9 μmol/g 。綜合兩種蛋白質(zhì)含量看，含糖量2％ 時(shí)較為理想。
2.1.5 外源酶的添加量對(duì)蛋白質(zhì)的影響試驗(yàn)結(jié)果
由圖５ 可知，隨著酶添加量的增加，可溶性蛋白質(zhì)的含量呈上升趨勢(shì)，酶添加量在0.15％ ～ 0.3％時(shí)，曲線上升明顯，0.3％ ～ 0.6％ 時(shí)，上升趨勢(shì)稍緩，到0.75％ 時(shí)基本變化不大。說明酶的添加量對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的影響較大，但是添加量超過0.6％ 以后，對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的含量影響不大。大豆球蛋白的含量隨著酶添加量的增加，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，酶添加量在0.3％ 時(shí)，大豆球蛋白含量最低。綜合兩種蛋白質(zhì)的變化情況，0.3％ ～0.6％ 的酶添加量，較為理想。
2.1.6 中、酸性蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的影響試驗(yàn)結(jié)果
由圖６ 可知，可溶性蛋白質(zhì)含量隨著中、酸性蛋白酶比例的增大，曲線呈上升趨勢(shì)，開始曲線較為平緩，由2:1到3:1時(shí)，曲線上升明顯。大豆球蛋白的含量總體變化不大，基本處于16 μmol/g 附近，說明中、酸性蛋白酶比例的變化對(duì)球蛋白的影響不大。綜合兩種蛋白質(zhì)的含量，中、酸性蛋白酶比例確定為3:1較為理想。
2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果
根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定含糖量為2％ 、中、酸性蛋白酶比例為3:1，選定發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始水分、外源酶添加量4個(gè)因素，進(jìn)行4因素、3水平的正交試驗(yàn)，因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。
由表２ 可知，對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量影響因素順序?yàn)椋築 ＞ A ＞ D ＞ C 。即主要因素是發(fā)酵溫度，次主要因素是發(fā)酵時(shí)間，初始水分與外源酶的添加量為次要因素。最佳組合為A3 B2 C1 D2 。即：發(fā)酵時(shí)間為7 d 、發(fā)酵溫度40 ℃ ，初始水分為40％ 、外源酶添加量為0.45％ 。
對(duì)大豆球蛋白含量影響因素順序?yàn)椋築 ＞ A ＞C ＝ D 。即：主要因素為發(fā)酵溫度、次主要因素為發(fā)酵時(shí)間，初始水分與外源酶的添加量為次要因素，且二者數(shù)值相同。最佳組合為A3 B2 C3 D2 ，即發(fā)酵時(shí)間為7d 、發(fā)酵溫度40 ℃ ，初始水分為60％ 、外源酶添加量為0.45％ 。
因此，總的影響因素順序?yàn)锽 ＞ A ＞ D ＞ C ；從最佳組合上看，初始水分差別較大，考慮到水分過高，會(huì)增加較大的干燥成本，確定初始水分為40％ 。因此總的最佳組合為A3 B2 C1 D2。
2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定含糖量為２％ 、中、酸性蛋白酶比例為３ ∶ １ 、發(fā)酵時(shí)間為７ d 、發(fā)酵溫度40 ℃ ，初始水分為40％ 、外源酶添加量為0.45％ ，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為可溶性蛋白的含量為165.8 μmol/g ，大豆球蛋白的含量為11.4 μmol/g ，效果理想。
研究了多菌混合固態(tài)發(fā)酵的工藝條件，以可溶性蛋白質(zhì)和大豆球蛋白含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，確定了發(fā)酵工藝的含糖量為2％ ，中、酸性蛋白酶比例為3：1 。做了發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始水分、外源酶添加量的四因素三水平的正交試驗(yàn)，得出：發(fā)酵溫度為主要因素，發(fā)酵時(shí)間為次主要因素，初始水分、外源酶添加量為次要因素；最佳組合為A3 B2 C1 D2，即發(fā)酵時(shí)間為7d 、發(fā)酵溫度40 ℃ ，初始水分為40％ 、外源酶添加量為0.45％ 。該條件下發(fā)酵豆粕的可溶性蛋白質(zhì)含量為165.8μmol/g ，大豆球蛋白的含量為11.4μmol/g 。3結(jié)論
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