發酵飼料菌種配比篩選與發酵工藝優化

2021-06-02 15:28:22 點擊：

摘要：試驗通過選擇枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母菌和保加利亞乳桿菌作為混合發酵劑發酵全價飼料，可以進一步提高飼料利用率。在確定三種菌最佳混合比例的基礎上，對飼料發酵參數進行進一步優化，探討鐵腳麻雞發酵飼料的最佳工藝，為提高養殖效益提供理論依據。

枯草芽孢桿菌是耗氧菌，發酵過程消耗大量的養分，維持厭氧的環境，促進厭氧菌乳酸菌生長，同時也抑制有害耗氧菌的生長；乳酸菌主要是產酸，對飼料質量起到關鍵性作用；酵母菌是兼性厭氧菌，生長環境較寬，能產酸和大量的菌體蛋白。三種菌種的功效各不相同，采用三種菌種的最佳的混合配比，能夠讓其發酵的飼料營養更平衡、更利于吸收。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌、乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌；YPD、LB、MRS培養基、超凈工作臺、搖床培養箱、發酵菌種、配合飼料等試驗器材。

1.1.1 固體培養基

1）YPD固體每300mL水中蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖、葡萄糖：6g、3g、6g、6g、6g單獨滅菌,然后加入300mL無菌蒸餾水中在121℃滅菌。

2）LB固體每300mL水中蛋白胨、酵母粉、氯化鈉：3g、1.5g、3g，在121℃滅菌鍋中滅菌。

3）MRS固體體培養基18.9g/300mL在121℃進行滅菌。

4）生理鹽水ac10.9%；Nacl:7.2g+800mL蒸餾水。

1.1.2 液體培養基

1）YPD液體。稱酵母浸膏1g加入80mL蒸餾水中溶解，葡萄糖2g加入20mL蒸餾水中溶解，分別滅菌溫度為121℃，后混合。

2）LB液體。酵母浸膏0.5g、蛋白胨1g、Nacl 1g，加無菌蒸餾水至100mL。

3）MBS液體。成品：5.224g/100mL加無菌蒸餾水，封口121℃無菌鍋滅菌。

1.2 試驗方法

滅菌：將配制YPD、LB、MRS培養基（固液），3個10mL離心管、100μL、1mL規格槍頭、無菌生理鹽水等進行滅菌；

分裝：打開無菌超凈工作臺,三個10mL離心管做好標記，分別加入YPD、LB、MRS液體培養基8mL；

接種：將酵母菌80μg、枯草芽孢桿菌80μL、乳酸桿菌80μL分別加入到含有對應培養基的離心管中，并密封好；

培養：將酵母菌在28℃、15h、搖床培養、有氧，枯草芽孢桿菌：35℃、20h、搖床培養、有氧，乳酸桿菌：37℃、15h、靜置培養、無氧。

1.3 觀察與計數

培養時間到后，取出進行染色鑒定、計數。酵母菌用美蘭染色法，枯草芽孢桿菌及乳酸桿菌用革蘭氏染色法，染色結束后進行鏡鑒。

2 結果與分析

2.1 菌種最佳配比濃度的篩選

2.1.1 平板菌落計數結果

本研究所使用的酵母菌在有氧條件下28℃搖床培養15h后進行菌落計數，枯草芽孢桿菌在有氧條件下35℃搖床培養20h后進行菌落計數，乳酸桿菌37℃靜置培養15h后進行菌落計數，原菌液的含菌量結果如表1所示。

2.1.2 菌種活化與濃度梯度配制

將三種菌的含菌量分別設三個水平（見表2），按L₉（3⁴）的正交表進行設計。最后將不同配比的三種菌按1%的接種量接種到飼料中，在常溫下進行為期7天的發酵。飼料水分含量為45%。具體接種方法為：將底料與菌種混勻后裝入500mL罐頭瓶中進行發酵，每個罐頭瓶裝發酵料200g，發酵完成后對發酵飼料的質地、顏色、氣味等進行感官評定及菌落計數。

結合發酵飼料感官評定和活菌數測定結果，初步得出發酵用菌種配比為：酵母菌1.8×108cfu/mL、乳酸菌1.35×108cfu/mL、枯草芽孢桿菌4×1011cfu/mL。

2.2 混菌一次發酵參數的優化結果

2.2.1 發酵工藝設置與優化

本試驗先活化三種菌，分別獲取乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌，將三種活化菌分別制配成最佳菌種配比為酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌1.8×108、1.35×108、4×1011cfu/mL，在最佳菌種配比的條件下，以發酵溫度、發酵時間、飼料水分、微生物接種量4個因素為考察因子，每個因素設3個水平，按L₉（3⁴）正交試驗表進行試驗設計，共9種組合，每種組合做3次重復，最后以活菌數做為評判指標。

2.2.2 活菌數的測定

稱取0.6ｇ發酵飼料至裝有5.4mL無菌生理鹽水的10mL離心管中，在振蕩器上充分震蕩30min，用滅菌吸管吸取10ml至滅菌空試管中，在漩渦混合器上震蕩 3min，然后吸取1mL加入到9ml無菌生理鹽水中，在漩渦混合器上混合1min，進行10倍系列釋，選取3個適當的稀釋倍數，傾注平板，每個梯度做兩個平行，恒溫培養、計數，算出發酵飼料中的活菌數。發酵結束后，仔細觀察，可見發酵第五天飼料質地松軟、顏色為黃色，香味淡香為最佳。通過對發酵飼料的質地、顏色、氣味等進行感官評定及菌落計數，并進行常規養分的檢測，得出來水分含量為45%時，發酵的飼料比較好；溫度在25℃-30℃的時候發酵較好，此時產生的活菌數和活性物質含量達到最優。

3 結論

綜上所述，最佳菌種配比為酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌1.8×108、1.35×108、4×1011cfu/mL；鐵腳麻雞育肥期飼料發酵最佳工藝為發酵溫度為25-30℃，發酵時間為5天，飼料含水量為45%。

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