復合酶與酵母菌協同發酵葡萄皮渣生產豬飼料
摘要：研究了以纖維素酶和木聚糖酶與酵母菌協同發酵葡萄皮渣生產豬飼料的方法。根據豬飼料的國家標準檢測飼料中豆粕、麩皮、玉米面、葡萄皮渣等主要組分，利用正交試驗確定了最佳配比：葡萄皮渣、豆粕、麩皮、玉米面質量比為2：2：1：2；酶的最適條件：纖維素酶3U／g，木聚糖酶5U／g，作用溫度50℃，時間72h。產品的粗纖維質量分數為11.42(干基)，低于加酶前4.83。
葡萄酒工廠將葡萄壓榨后會產生大量皮渣，通常有兩種處理方法：一是作為粗飼料出售，不做加工，其營養價值比較低；二是作肥料傾倒或掩埋，但容易滋生病菌，污染環境。葡萄皮渣中含有較多的纖維物質，能快速通過豬的胃腸，導致養分的吸收利用率降低，因此會降低飼料利用效率。纖維素酶和木聚糖酶等組成的復合酶不但能降低粗纖維的含量，還能消除抗氧化因子，有效提高飼料的適口性和飼料的營養價值，對仔豬的生長也具有較大的促進作用。飼料中添加酵母菌已被廣泛的應用，酶解后所產生的糖可用于酵母菌的生長，不僅可以提高飼料蛋白的品質，還能產生香味物質，促進豬的食欲增加葡萄皮渣在配合飼料中所占的比例能降低飼料的成本，增加效益；但是比例過大，也會降低營養物質的均衡以及飼喂的效果，所以選擇合適的配合比例至關重要。本研究將葡萄皮渣與輔助農副產品豆粕、麩皮和玉米面等配合，經由復合酶降解和酵母發酵獲得多量的細胞蛋白，依據豬飼料國家標準制成配合飼料。
材料與方法
1 材料
葡萄皮渣，遼寧某酒業有限公司；
豆粕、麩皮，大連某食品集團調味食品廠；
玉米面，市售；復合酶(纖維素酶和木聚糖酶等)，黑龍江肇東某有限公司；
釀酒酵母，廣東某有限公司。
2 試驗方法
2.1 葡萄皮渣飼料發酵工藝
原料→篩選→混合→加水→潤料→滅菌→冷卻→加酶→翻拌→降溫→接種酵母→發酵→干燥→粉碎→成品。
2.2 操作要點
原料處理：剔除葡萄皮渣中的土塊、石頭等雜物。
原料混合：將原料葡萄皮渣、豆粕、麩皮和玉米面等按一定比例混合。
潤料：原料與水按照質量比2：1充分潤透，混合均勻，要求散而不凝，沒有結團。
滅菌條件：121℃蒸汽滅菌60min。加入復合酶：將滅菌后的原料冷卻至室溫，于無菌室中加入復合酶。
加酶量分別為：纖維素酶2.0、2.5、3.0U／g；木聚糖酶5、6、7U／g。
酶解：在50℃下恒溫72h，每日晃瓶2次，使發酵物松散、均勻。
接種活化酵母：活性干酵母按0.05%加入，使用前取適量無菌水，25℃活化2h。
酵母發酵：在30℃培養箱內發酵96h。
熱風干燥：將發酵飼料攤于淺盤中，50℃熱風風干12～24h。
3 檢測方法
3.1 水分的測定
根據GB/T 6435—2006采用直接干燥法。
3.2 蛋白質的測定
采用微量凱式定氮法。
3.3 粗纖維的測定
根據GB/T 6434—2006采用過濾法。
3.4 灰分的測定
根據GB/T 6438—2007采用灼燒法。
3.5 還原糖得率
采用DNS法。測定水解液中還原糖質量分數：將試樣放置在50℃的烘箱中12h，粉碎均勻后精確稱取1.0000g，加入適量去離子水，50℃水浴30min，待溶液冷卻后定容至100mI，再3000r／min離心5min，取上清液1mI進行DNS法檢測，根據葡萄糖溶液標準曲線確定還原糖質量分數。
式中：m1為酶解后的還原糖的質量，g；m0。為初始還原糖的質量，g；m2為50℃烘干試樣的質量，g；W為50℃烘干試樣的含水率%。
3.6 總糖的測定
精確稱取原料試樣，經過酸水解、堿中和后定容，離心，采用DNS法測定。
3.7 酵母菌數的測定
稱取10.00g發酵后飼料，加入50mI去離子水浸泡2min，上清液定容至250mL，采用血球計數板直接計數法測定。
結果與討論
1 原料主要成分
葡萄皮渣由于加工的方式不同，其化學組分含量也會有所差別。根據豬飼料的國家(行業)標準，飼料配伍中必須兼顧碳水化合物、有機氮、粗纖維物質等主要成分的比例，以及在飼料中的質量分數。試驗用的葡萄皮渣來自冰葡萄酒的壓榨原料。測定的主要成分結果見表1。表中也給出了豆粕、玉米面以及麩皮等擬配合農副產品的檢測結果。
由表1可見，葡萄皮渣中總氮含量較少，糖含量偏低，需采用其他農副產品補充其不足部分。玉米面含糖量較高，豆粕含氮量最高，麩皮的含氮量和含糖量適中，都是很好的營養源。
2 飼料配比
根據表1中原料的主要營養成分以及各種營養物質搭配的原則，在預試驗的基礎上設計成3種飼料配合比例，見表2。
配比的設計要考慮到盡可能多地利用葡萄皮渣，同時還要兼顧總氮等其他因素。由表2可知，雖然3個配比中粗纖維質量分數最小值是13.15，卻仍然達不到國家(行業)標準粗纖維質量分數≤11.77(絕干)的要求，因此需要復合酶降解一部分粗纖維以達到標準。
3 葡萄皮渣配合飼料的干燥溫度
制成的葡萄皮渣豬飼料需經過干燥，然后粉碎并取樣檢測。為了減少干燥時被檢測組分的損失，同時保證取樣均勻一致，采取風干方式。將發酵飼料在不同溫度下熱風干燥12h，檢測其中還原糖的變化。試驗從30～100℃，間隔10℃為一個梯度。結果見圖1。
在30~50℃時，美拉德反應速度緩慢，飼料中還原糖損失比較少；超過50℃則糖的損失明顯加快。所以本試驗確定熱風干燥條件為50℃、12h。此時水分已較低，可以方便地進行粉碎、取樣。50℃熱風干燥溫度也比較容易控制，具有能耗少、時問短、營養成分保留完好的優點，適宜在生產中應用。
4 復合酶酶解工藝
影響復合酶水解的主要因素，包括底物配比、加酶量、作用溫度和時間等。在葡萄皮渣配合飼料的3種配比中，粗纖維含量各不相同，因而酶解的底物量也不同。纖維素酶和木聚糖酶的比例直接影響復合酶的酶解效率。最佳工藝條件采取正交試驗法確定，選擇正交表L9(34)。根據表2和圖1的結果，因素水平表如表3所示。
按照正交試驗設計方案L9(34)進行飼料(配比)中的粗纖維降解試驗，分別檢測9組試驗組合中的還原糖并計算得率，結果列于表4中。
將表4中極差分析結果最次要的因素B作為空列，進行方差分析，結果見表5。因素A影響較顯著，因素C和D均為影響顯著。因素作用的主次作用順序是D>C>A，最優水平組合為A2C3D3復合酶的3種配比水平影響不大，因此考慮到復合酶的成本因素，因素B選擇B1，則最優組合為A2B1C3D3，即酶解最優條件為：配比二——葡萄皮渣、豆粕、麩皮、玉米面質量比為2：2：1：2，纖維素酶加入3U／g原料，木聚糖酶加入5U／g原料，酶解溫度為0℃，時間72h。
由于最優工藝條件組合沒有含在表4的9組試驗中，需要進行驗證試驗，結果還原糖得率為4.70％，高于表4中最好的A1B3C3D3組合的結果。
5 發酵過程中還原糖含量的變化
通過酵母菌發酵可以進一步軟化飼料，同時產生酒香和酯香氣味，提高飼料的適口性和營養價值。將3種飼料配比(表2)分別經過酶解以后，接種0.05活性干酵母，從72h開始發酵至168h，共計4d，發酵溫度為30℃。降糖曲線見圖2。
6 發酵過程中酵母數量的變化
酵母菌發酵從72h開始。3種飼料配比中酵母菌生長過程曲線見圖3。
由圖3可見，3組配比中的酵母數量在72～96h增長很快，而后逐漸緩慢。組二和組三的酵母生長比較旺盛，至168h時達到1.6×106個細胞，是發酵前的8倍左右而組l中的酵母菌生長緩慢。發酵后期，由于還原糖被消耗，產物不斷生成，酵母生長速率降低。
7 發酵前后飼料中主要成分含量的變化
葡萄皮渣、豆粕、麩皮和玉米面按一定的比例配合，經復合酶酶解和酵母菌發酵后，粗纖維含量明顯降低，酒味和酯味比較突出。表6為發酵前后配合飼料中總氮和粗纖維含量的變化數據。將較優的第2組配比飼料制成后，經過50℃熱風干燥24h后測定總氮和粗纖維含量，結果見表6所示。
由表6可見，配比二在發酵前后總氮含量變化不大，一部分飼料的蛋白質在酵母發酵過程中轉變成菌體蛋白，提高了飼料蛋白的品質。發酵后粗纖維降低了4.83，低于飼料行業標準；消化能值根據化學成分和總能計算為13.53MJ／kg，略高于飼料行業標準。
結論
葡萄皮渣配合飼料最適配合比例：葡萄皮渣、豆粕、麩皮、玉米面質量比為 2：2：1：2。復合酶的最佳配比為：纖維素酶3U／g，木聚糖酶5U／g，作用溫度為50℃，時間為72h。發酵后的飼料成品中總氮18.81，粗纖維11.42，消化能值13.53MJ／kg，均達到了國標(行業)妊娠豬飼料要求。
研究發現，葡萄皮渣含有少量的糖分，氮含量偏低。脫水可以提高氮的含量，但同時也會增加粗纖維的含量。將豆粕、麩皮、玉米面與葡萄皮渣配合可以彌補葡萄皮渣的不足，但是粗纖維含量稍高于飼料行業標準。以纖維素酶和木聚糖酶為主的復合酶可以降解飼料粗纖維。試驗中，復合酶將葡萄皮渣占27.2的配比二中的粗纖維降低了4.83，使之符合飼料標準。同時，最優的酶解條件A2B1C3D3將還原糖得率提高至4.70，為酵母菌生長和發酵提供了良好條件。
發酵飼料經過50℃熱風干燥后，主要營養成分和風味物質基本無損失，產品中有少量還原性糖，其中的酵母菌也是優良的蛋白質資源，蛋白質含量大為提高。干燥的葡萄皮渣飼料成品有酒香、酯香和原料香味，提高了飼料的適口性。
葡萄皮渣配合飼料較普通配合飼料節約了成本，增加了經濟效益。飼料中還可加入乳酸菌，有助于營養物質的消化和吸收，提升飼料的品質。飼料中賴氨酸的含量和磷、鈣的含量也是影響飼料品質的因素，有待于進一步研究。
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