酵母菌發酵對常用飼料原料營養指標和抗營養因子含量的影響
隨著全球經濟的蓬勃發展和人們生活水平的不斷提高，人類對于畜產品的需求量逐年增大，從而促使畜牧業在規模與質量上不斷發展。在全球人口日益增多的背景下，如何利用生物技術方法開發新型飼料資源并提高動物對原有飼料原料利用率成為解決不斷增長的畜產品需求量和日益緊縮的耕地面積之間矛盾的有效途徑之一。
研究表明，飼料經益生菌發酵后，菌種產生的多種代謝產物不僅能夠提高飼料原料中蛋白質、脂肪和糖類等成分的營養轉化率，同時能夠降解常用飼料原料中的抗營養因子等有害成分，擴大飼料原料的使用范圍，提高原有飼料的營養價值。另外，發酵飼料能夠改善飼料適口性，調節動物腸道的微生態平衡，提高了畜禽產品的食品安全性。目前，應用于微生物發酵飼料的菌種類型主要有酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、曲霉等。其中，酵母菌是單細胞真核微生物的一種，能夠發酵糖類物質，其本身含有豐富的氨基酸、維生素、酶類等物質，是直接食用最多的一種微生物，在畜牧業生產中已有廣泛的應用。本研究分別采用釀酒酵母、熱帶假絲酵母和馬克思克魯維酵母對５種常用飼料原料小麥、玉米、豌豆、大豆和豆粕進行發酵處理，對發酵前后的營養指標和抗營養因子含量進行比較測定，為發酵原料在飼料工業中的應用提供理論基礎和技術支撐。
１ 材料與方法
１.１ 試驗材料
１.１.１ 菌種
熱帶假絲酵母（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）和釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。馬克思克魯維酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ）由淮陰師范學院生命科學學院張瞳老師饋贈。
１.１.２ 原料及處理
發酵原料為市售小麥、玉米、豌豆、大豆和豆粕。將原料除雜后進行粉碎，過４０目篩，作為酵母菌發酵基礎料。
１.１.３ 培養基配制
１號試劑：酵母膏１０ｇ，蛋白胨２０ｇ，瓊脂粉２０ｇ（液體培養基不加），蒸餾水９００ｍＬ；２號試劑：葡萄糖２０ｇ，蒸餾水１００ｍＬ。將１號試劑瓶和２號試劑瓶分別配制滅菌，待溫度冷卻至６０～７０℃后混合均勻。
１.１.４ 試驗地點及時間
試驗地點為淮陰師范學院生命科學學院，試驗時間為２０１８年３—５月。
１.２ 試驗方法
１.２.１ 菌的活化及擴大培養
將酵母菌凍干粉瓶打碎后，用液體培養基溶解，吸取１００μＬ接種至固體培養基表面，均勻涂布，３０℃培養２４～４８ｈ后，選擇菌落生長良好的培養皿，相同條件下進行劃線培養，挑取單菌落，裝入液體培養基中震蕩培養，菌懸液混合均勻后按照１∶５０接種量擴大培養，測定菌液Ｄ值，制備接種菌液。
１.２.２發酵
每種原料稱取２００ｇ，１１０℃加熱７ｍｉｎ，各種酵母的接種量均為１.０×107ｃｆｕ／ｇ，原料與水分比例為１∶１。混合均勻后，裝入發酵袋中排空空氣靜置發酵，發酵溫度為３０℃，發酵時間為２４、４８、７２、９６ｈ。每隔１２ｈ檢查１次將袋中氣體排空，發酵完畢后樣品置于－２０℃冰箱里待測。
１.３ 指標測定
１.３.１ ｐＨ值的測定
取每株菌發酵的各時間段的每種發酵原料樣品５ｇ于小燒杯中，加入４５ｍＬ蒸餾水，每隔５ｍｉｎ攪拌１次，共攪拌３次，靜置１０ｍｉｎ后，ｐＨ計測量。
１.３.２ 干物質回收率的測定
干物質測定方法參照ＧＢ／Ｔ８３０３—２０１３《茶 磨碎試樣的制備及其干物質含量測定》，計算公式：干物質回收率＝（發酵原料干物質質量／發酵原料質量）／（原料干物質質量／原料質量）×１００％。
１.３.３ 還原糖含量的測定
參照王俊剛等的３，５－二硝基水楊酸法測定。準確稱取２.０ｇ樣品于１００ｍＬ三角瓶中，加入約５０ｍＬ蒸餾水，于５０℃恒溫水浴中保溫２０ｍｉｎ，期間不時攪拌使還原糖浸出。靜止三角瓶使樣品沉淀，吸取上清液８ｍＬ于離心管中，３０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，將上清液轉移至新離心管中，此即為還原糖測定樣品。還原糖含量以ｍｇ／ｇ計算。
１.３.４ 粗蛋白含量的測定
依據ＧＢ／Ｔ６４３２—１９９４《飼料中粗蛋白測定方法》凱式定氮法進行測定。稱取０.３ｇ左右測定干物質時烘干至恒重的樣品，加入催化劑和硫酸，進行消化，直至溶液透明呈藍綠色，待其冷卻，應用自動凱氏定氮儀測定其含氮量。
１.３.５ 植酸含量測定方法
采用分光光度法測定植酸含量。步驟大致如下：（１）稱取０.５ｇ樣品，加入６ｍＬ１.８ｍｏｌ／ＬＨＣｌ，３５℃水浴２ｈ，期間不斷振蕩，水浴后靜置過夜；（２）樣品４０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，取上清液，加入０.４ｍＬ鐵試劑，沸水浴４５ｍｉｎ后再次離心，棄上清液；（３）用３ｍＬ１.５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ對沉淀進行溶解，再次離心，棄上清液；（４）加入１ｍＬ３.２ｍｏｌ／Ｌ硝酸溶解沉淀后，依次加入０.２ｍＬ９％的檸檬酸三鈉、０.２ｍＬ１％對苯二酚、０.４ｍＬ０.４％鄰菲羅啉，純水定容至５０ｍＬ，ｐＨ值調節至３～４；（５）３５℃水浴２ｈ后自然冷卻，于５１０ｎｍ波長處測定吸光度。計算公式：植酸含量＝Ｄ５１０ｎｍ×８.４２÷樣品質量（ｍｇ）×１.２５×１００％。
１.３.６ 抗性淀粉含量的測定
參照高鑫（２０１２）的方法。步驟大致如下：（１）準確稱取０.２ｇ樣品于帶塞玻璃試管中，加入蒸餾水０.４ｍＬ，沸水浴２０ｍｉｎ后冷卻至室溫；（２）加入ＨＣｌ－ＫＣｌ緩沖溶液（ｐＨ值為２.０）２.５ｍＬ和１０％胃蛋白酶１０５μＬ，３７℃恒溫振蕩１ｈ；（３）加入４ｍＬ的醋酸鈉緩沖液（ｐＨ值＝６.９）和淀粉酶－糖化酶混合溶液４ｍＬ，３７℃振蕩１６ｈ；（４）４０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，去掉上清液，５０％乙醇溶液洗滌沉淀，重復２次；（５）依次加入２ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＫＯＨ溶液，８ｍＬ醋酸鈉緩沖液（ｐＨ值為３.８），１００μＬ糖化酶溶液，６０℃水浴１ｈ；（６）冷卻至室溫，４０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，保留上清液；（７）根據“１.３.３”節還原糖測定方法測定上清液中的還原糖含量。計算公式：抗性淀粉含量＝還原糖含量×０.９。
１.４ 數據處理
統計學分析采用ＳＰＳＳ１７.０（ＳＰＳＳＩｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）軟件的Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ進行統計分析，計算結果以“平均值±標準誤”表示。Ｐ＜０.０５表示差異顯著。
２ 結果與分析
２.１ 不同飼料原料經３種酵母菌發酵后ｐＨ值的變化規律
由圖１可知，小麥和玉米分別經３種酵母發酵２４ｈ后ｐＨ值均顯著降低（Ｐ＜０.０５），且于４８～９６ｈ內趨于穩定水平，呈明顯的酸性。豌豆和豆粕分別經釀酒酵母和熱帶假絲酵母發酵２４ｈ后ｐＨ值均顯著降低（Ｐ＜０.０５），但隨后于７２ｈ后逐漸恢復至初始ｐＨ值。大豆原料經３種酵母發酵７２ｈ后ｐＨ值均顯著升高（Ｐ＜０.０５），呈明顯堿性。
２.２ 不同飼料原料經３種酵母菌發酵后干物質回收率的變化規律
由圖２可知，小麥原料經３種酵母發酵７２ｈ后干物質回收率顯著降低（Ｐ＜０.０５），玉米原料經釀酒酵母發酵后干物質回收率呈現先降低后升高的趨勢，而經熱帶假絲酵母和馬克斯克魯維酵母發酵７２ｈ和９６ｈ后干物質回收率則顯著降低（Ｐ＜０.０５）。豌豆經釀酒酵母和熱帶假絲酵母發酵９６ｈ后干物質回收率顯著降低，但不受馬克斯克魯維酵母發酵影響（Ｐ＞０.０５）。大豆分別經熱帶假絲酵母和馬克斯克魯維酵母發酵７２ｈ和４８ｈ后干物質回收率顯著降低（Ｐ＜０.０５），豆粕原料分別經釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母發酵７２ｈ后干物質回收率顯著降低（Ｐ＜０.０５），而經熱帶假絲酵母發酵７２ｈ后干物質回收率卻顯著上升（Ｐ＜０.０５）。
２.３ 不同飼料原料經３種酵母菌發酵后還原糖含量的變化規律
由圖３可知，玉米原料分別經釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母發酵２４ｈ后還原糖含量顯著下降（Ｐ＜０.０５），而大豆、豌豆和豆粕原料經２種酵母發酵后還原糖含量均表現出先升高后降低的規律。豌豆原料經熱帶假絲酵母發酵２４ｈ后還原糖含量顯著降低（Ｐ＜０.０５），而其他原料均表現出先升高后降低的規律。
２.４ 不同飼料原料經３種酵母菌發酵后粗蛋白含量的變化規律
由圖４可知，釀酒酵母發酵豆粕原料９６ｈ時粗蛋白含量顯著降低（Ｐ＜０.０５），而發酵其他４種飼料原料對蛋白含量無顯著影響（Ｐ＞０.０５）。熱帶假絲酵母發酵小麥、玉米、大豆和豆粕４種原料７２～９６ｈ內粗蛋白含量均出現顯著升高現象（Ｐ＜０.０５）。馬克斯克魯維酵母發酵玉米２４ｈ時，粗蛋白含量顯著升高（Ｐ＜０.０５），但隨后降低至初始水平，而發酵豆粕原料７２ｈ后粗蛋白含量顯著升高（Ｐ＜０.０５）。
２.５ 不同飼料原料經３種酵母菌發酵后植酸含量的變化規律
由圖５可知，釀酒酵母發酵２４ｈ后，大豆、豆粕、小麥植酸含量顯著降低（Ｐ＜０.０５）；豌豆發酵７２ｈ后，植酸含量的去除率達到４９．３％（Ｐ＜０.０５）；玉米的植酸含量在發酵４８ｈ內無顯著變化（Ｐ＞０.０５）。熱帶假絲酵母發酵２４ｈ時，大豆、豌豆、小麥植酸含量顯著降低（Ｐ＜０.０５）；發酵４８ｈ之后豆粕植酸含量的去除率達到５５．３％（Ｐ＜０.０５），玉米的植酸含量無顯著變化（Ｐ＞０.０５）。馬克思克魯維酵母發酵２４ｈ后，大豆、豆粕、小麥植酸含量顯著降低（Ｐ＜０.０５），玉米與豌豆發酵４８ｈ后植酸含量顯著降低（Ｐ＜０.０５）。馬克思克魯維酵母對大豆植酸含量降低效果最為顯著，對其植酸去除率達到６８.１％。
２.６ 不同飼料原料經３種酵母菌發酵后抗性淀粉含量的變化規律
由圖６可知，釀酒酵母發酵４８ｈ后，小麥原料的抗性淀粉含量顯著降低（Ｐ＜０.０５），而豌豆和玉米則在發酵７２ｈ抗性淀粉含量顯著降低（Ｐ＜０.０５）。豌豆和小麥經熱帶假絲酵母發酵２４ｈ后抗性淀粉含量顯著降低（Ｐ＜0.０５）。馬克思克魯維酵母發酵４８ｈ后豌豆抗性淀粉含量降低４４％（Ｐ＜０.０５）；發酵７２ｈ后，小麥與玉米抗性淀粉含量分別降低了４３％和５２％（Ｐ＜０.０５）；大豆和豆粕則在發酵過程中抗性淀粉含量無顯著變化（Ｐ＞０.０５）。
３ 討論
ｐＨ值是生物發酵工藝中的一個非常重要的參數，飼料原料發酵過程中ｐＨ值降低主要歸結于發酵菌種增殖過程中產生并積累的有機酸，微生物發酵飼料中酸含量的增加反過來有利于飼料的長期保存。本試驗中，小麥和玉米原料經釀酒酵母、熱帶假絲酵母和馬克斯克魯維酵母發酵后ｐＨ值均呈現顯著下降趨勢。研究發現，酵母菌本身產酸能力并不強，在發酵過程中可將葡萄糖代謝產物———丙酮酸轉化為乳酸、乙酸或乙醇，這可能是誘發原料ｐＨ值在發酵初期降低的因素之一。隨著發酵后期乙醇的積累，酵母細胞的生長受到抑制，丙酮酸代謝產酸途徑被切斷，因此ｐＨ值無法持續降低。也有研究人員認為，原料本身未被滅菌的乳酸菌在發酵過程中得到一定程度的增殖，且酵母菌增殖過程中產生的丙酮酸、琥珀酸等代謝產物能夠刺激乳酸菌的活動，為其提供營養物質，因而誘導原料ｐＨ值的迅速降低。本試驗還發現大豆在酵母菌發酵后期ｐＨ值逐漸升高，說明蛋白類原料和淀粉類原料被酵母菌發酵的效果存在較大差異。作者推測這種差異可能歸結于酵母菌在不同發酵底物下積累的代謝產物不同所導致，在本試驗發酵過程中發現，大豆發酵后期出現腥味，可能是揮發性氨類和硫化物。劉倚帆等報道，酵母菌和米曲霉協同發酵整粒菜籽后期ｐＨ值也出現一定程度的升高。因此，全脂大豆或菜籽中較高含量的蛋白質以及脂肪可能是酵母菌發酵后期ｐＨ升高的主要因素。本研究中豆粕和豌豆在３種不同酵母菌發酵下ｐＨ值呈現不同的變化規律也說明不同酵母菌在單一發酵底物下的代謝方式和途徑存在一定差異。
Ｔｅｒｅｂｉｚｎｉｋ等認為益生菌固態發酵過程中干物質損失量和生物量呈正相關。這一點在馬克斯克魯維酵母發酵中尤為明顯，酵母菌分解利用發酵底物中的物質合成自身成分，并釋放出代謝產物，在這一過程中，干物質量在發酵后期呈現明顯的下降趨勢。但本試驗也發現，熱帶假絲酵母發酵豆粕后期干物質回收率出現升高趨勢，說明發酵物料中的生物量增長速度超過了發酵底料的消耗速度，筆者推測這種現象可能只是短暫出現，隨著發酵的繼續進行，發酵底物的消耗速度勢必會超過生物量的增長。
酵母菌最重要的營養物質和能量來源大部分來自于單糖，而發酵纖維素等多糖的能力有限，這一點與枯草芽孢桿菌不同。大量研究報道，在果酒、泡菜等釀造發酵過程中，酵母菌能夠迅速降解底物中已有的還原糖成分，將其轉化為酸類、酯類或醇類物質。本研究結果發現，玉米分別經釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母發酵后還原糖含量持續下降，而大豆、豌豆和豆粕原料經２種酵母發酵后還原糖含量均表現出先升高后降低的規律。豌豆經熱帶假絲酵母發酵后還原糖含量持續降低，而其他原料均表現出先升高后降低的規律。由此說明，不同酵母菌作用于不同飼料原料底物，產生能夠分解多糖的酶的性質不同，后期當淀粉等多糖經酵母菌酶解成為還原糖后反過來又促進了酵母菌的增殖。
本研究結果表明，熱帶假絲酵母發酵小麥、玉米、大豆和豆粕４種原料可提高原料的粗蛋白水平，這一點優于釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母。研究報道，生產上利用淀粉、葡萄糖、玉米深加工副產物等作為熱帶假絲酵母、釀酒酵母大量培養的底物，酵母本身蛋白質含量為４５％～６０％，其大量增殖的同時提高了發酵底物的粗蛋白含量，從而使底物的可飼性大大提高，可最大限度上替代魚粉等其他動物源蛋白質飼料。本研究中單一飼料原料的成分及含量均有所不同，可能是造成不同酵母增殖效果差異的重要因素。
植酸在植物種子的胚芽和谷物的麩皮中含量較高，尤其是在豆科植物的種子中含量最高。植酸可與常見的礦物元素產生不溶性化合物，大大降低其有效性，因而成為重要的抗營養因子之一。本試驗測定結果顯示，大豆和豌豆中植酸含量較高，但豆粕中植酸含量甚至低于玉米和小麥。這可能與大豆在壓榨獲得油脂過程中經歷高溫高壓等物理因素有關。研究報道，酵母菌能夠有效降解植物籽實中的植酸，因而有利于單胃動物對飼料中營養物質的吸收和利用，這可能與酵母菌能夠產植酸酶有直接關系。本試驗中馬克思克魯維酵母在發酵４８ｈ后各原料的植酸含量下降均較為明顯，顯示出較好的去除效果，因而在實際生產上具有一定的借鑒意義。
抗性淀粉是一種細胞壁成分，部分與水相溶形成粘性物質，阻礙了動物對營養物質的吸收。本試驗中酵母菌對玉米、小麥和豌豆等抗性淀粉含量較高的原料降解效果較好，而對大豆和豆粕的抗性淀粉降解效果較差。目前利用微生物發酵法降解植物籽實中的抗性淀粉尚未見報道。筆者認為不同原料中抗性淀粉的類型存在差異，酵母菌在不同底物上的發酵效果也有所不同，分解抗性淀粉可能主要靠分泌的纖維素酶或淀粉酶發揮作用，但由于酵母菌對復雜多糖的利用效果有限，因此僅依靠酵母菌發酵難以達到有效降解飼料中抗性淀粉的目的。
綜上所述，不同種類酵母菌對能量型和蛋白型飼料原料的發酵效果存在差異。總體上，經過３種酵母菌發酵后的能量型飼料（小麥和玉米）酸度顯著增加，而蛋白型飼料（豌豆、大豆和豆粕）經釀酒酵母和熱帶假絲酵母發酵后期ｐＨ值升高。通過控制菌種和時間可在發酵早期增加原料中還原糖和粗蛋白的含量，但隨著發酵的進行，還原糖逐漸被消耗。此外，３種酵母菌能夠有效降解飼料原料中的植酸，但僅對能量型飼料的抗性淀粉有一定的降解效果。
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