酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料的研究
玉米是我國(guó)主要農(nóng)作物之一，在我國(guó)北方大面積種植，每年都會(huì)產(chǎn)生大量的玉米秸稈，年產(chǎn)量約為2.4 億t。由于其粗纖維含量較高，動(dòng)物消化吸收率低，營(yíng)養(yǎng)成分減少，適口性降低。除少部分被用作家畜的粗飼料和秸稈還田作肥外，其余秸稈均被焚燒廢棄，利用率不足10%，這樣既造成了天然資源的巨大浪費(fèi)，也污染了環(huán)境。因此，如何提高玉米秸稈飼料的適口性、利用率和消化率，降低其對(duì)環(huán)境的污染，成為亟待解決的問(wèn)題。玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分組成，并共存于植物纖維原料中。由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，嚴(yán)重阻礙了酶解的進(jìn)行。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)玉米秸稈發(fā)酵飼料進(jìn)行了廣泛研究，主要集中在不同預(yù)處理方法的研究、纖維素酶降解條件的優(yōu)化以及多菌種發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料等方面，在秸稈降解方面取得了一定的效果，然而粗蛋白含量仍較低。為提高玉米秸稈發(fā)酵飼料的粗蛋白含量，利用纖維素酶和酵母菌種共同發(fā)酵玉米秸稈，發(fā)揮酶、菌的相互作用，并研究酶菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響因素，以期為利用玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料提供一種新途徑。
1材料與方法
1.1 材料
1.1.1 原料
玉米秸稈取自唐山市某大田，粉碎過(guò)841μm篩，備用。
1.1.2 菌種和酶
安琪酵母(釀酒曲)、纖維素酶由華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
1.1.3 主要儀器
722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)購(gòu)自上海光譜儀器有限公司;101－1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司;DNP－902電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YXQ－280SI型手提式高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)自上海經(jīng)濟(jì)區(qū)嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司;TDA－8002電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自余姚市東方電工儀器廠;SKD－2000全自動(dòng)凱氏定氮儀購(gòu)自上海沛歐分析儀器公司。
1.2 方法
1.2.1 最佳發(fā)酵劑確定
按照玉米秸稈發(fā)酵對(duì)發(fā)酵劑的不同需求，添加纖維素酶(0.8%)、纖維素酶與酵母混合物(8︰20)進(jìn)行發(fā)酵，同時(shí)以未添加發(fā)酵劑的發(fā)酵產(chǎn)物為對(duì)照(CK)，測(cè)定發(fā)酵飼料的粗蛋白含量，確定最佳的發(fā)酵劑種類。
1.2.2 酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈制備蛋白飼料的單因素試驗(yàn)
1.2.2.1 發(fā)酵時(shí)間
在發(fā)酵溫度35℃、料液比1︰20、酶菌比例8︰20條件下，研究不同發(fā)酵時(shí)間(18h、28h、38h、48h、58h、68h)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響。
1.2.2.2 酶菌比例
在發(fā)酵時(shí)間48h、溫度35℃、料液比為1︰20條件下，研究不同酶菌復(fù)配比例(8︰5、8︰10、8︰15、8︰20、8︰25)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響。1.2.2.3料液比在發(fā)酵時(shí)間48h、溫度35℃、酶菌比8︰20條件下，研究不同料液比(1︰25、1︰22、1︰20、1︰18、1︰16)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響。1.2.2.4發(fā)酵溫度在發(fā)酵時(shí)間48h、料液比1︰20、酶菌比例8︰20條件下，研究不同溫度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響。
1.2.3 酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈制備蛋白飼料的正交試驗(yàn)
以粗蛋白含量為考察指標(biāo)，考察發(fā)酵時(shí)間、酶菌比例、料液比和發(fā)酵溫度對(duì)粗蛋白含量的影響。設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，因素及水平如表1。
1.2.4 粗蛋白含量測(cè)定
采用微量凱氏定氮法測(cè)定樣品的含氮量。粗蛋白含量=6.25×含氮量×100%。
1.3 數(shù)據(jù)處理
應(yīng)用Excel軟件對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用正交設(shè)計(jì)助手3.1版軟件對(duì)正交試驗(yàn)的因素與水平進(jìn)行直觀分析和方差分析。
2結(jié)果與分析
2.1 玉米秸稈發(fā)酵最佳發(fā)酵劑的確定
由圖1可知，在相同的發(fā)酵條件下，未添加發(fā)酵劑(CK)時(shí)，玉米秸稈發(fā)酵后所得粗蛋白含量為5.24%，培養(yǎng)基中添加纖維素酶、纖維素酶與酵母菌混合物后，粗蛋白含量分別為20.11%和24.78%，均遠(yuǎn)高于對(duì)照組。采用纖維素酶和酵母混合培養(yǎng)即酶菌協(xié)同發(fā)酵時(shí)，粗蛋白含量最高，其原因可能是利用纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為單糖(葡萄糖)、雙糖后，立即被酵母菌所利用，同時(shí)將培養(yǎng)物中部分無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，達(dá)到使秸稈飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高的目的。故采用酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料。
2.2 玉米秸稈發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 發(fā)酵時(shí)間
由圖2可知，發(fā)酵時(shí)間為18h時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量最低，為14.88%，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，粗蛋白含量逐漸升高，48h以后呈降低趨勢(shì)。發(fā)酵48h時(shí)，粗蛋白含量最高，為25.75%。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為48h。
2.2.2 酶菌比例
由圖3可知，當(dāng)酶菌的復(fù)配比例為8︰5時(shí)，粗蛋白含量最低，為12%。當(dāng)酶菌復(fù)配比例為8︰20時(shí)，發(fā)酵飼料中的粗蛋白含量最高，為24.38%。其發(fā)酵產(chǎn)物色澤淡黃，帶有酒香，干燥后色澤變化不大。因此，最佳酶菌復(fù)配比例為8︰20。
2.2.3 料液比
由圖4可知，當(dāng)料液比較低時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)基質(zhì)中料液比為1︰20時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量達(dá)到最高，為27.75%。可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)基中顆粒疏松度合適，有利于酵母菌生長(zhǎng)繁殖，繼續(xù)提高培養(yǎng)基中的料液比，粗蛋白含量反而降低。因此，適宜的料液比為1︰20。
2.2.4 發(fā)酵溫度
由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵物粗蛋白含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)基溫度為35℃時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量達(dá)到最高，為27.80%，這可能是因?yàn)?5℃時(shí)菌種活度和含量較為適宜，有利于玉米秸稈飼料中纖維素分解，粗蛋白含量增加。因此，適宜的溫度為35℃。
2.3 玉米秸稈發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析
由表2的極差分析可知，各因素對(duì)玉米秸稈發(fā)酵產(chǎn)粗蛋白的影響順序由大到小為A＞B＞D＞C，即發(fā)酵時(shí)間＞酶菌比例＞發(fā)酵溫度＞料液比，最佳組合方式為A2B1C2D2，即發(fā)酵時(shí)間48h，纖維素酶和酵母菌混合比例為8︰15，料液比1︰20，培養(yǎng)溫度35℃。由表3方差分析的結(jié)果可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵飼料粗蛋白含量的影響達(dá)顯著水平，而酶菌比例、料液比和發(fā)酵溫度的影響不顯著，與直觀分析結(jié)果一致。在上述最優(yōu)發(fā)酵條件下，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量平均為29.71%，達(dá)到蛋白質(zhì)飼料所要求的含量，與發(fā)酵前的粗蛋白含量(5.24%)相比，提高了4.67倍。且發(fā)酵產(chǎn)物色澤淡黃，帶有酒香，營(yíng)養(yǎng)成分增加，適口性好，這樣在一定程度上有利于動(dòng)物吸收，提高玉米秸稈的利用價(jià)值。
結(jié)論與討論
本試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料的工藝進(jìn)行研究。首先，對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵與單獨(dú)纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白飼料的工藝進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，酶菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)的粗蛋白含量?jī)?yōu)于單獨(dú)纖維素酶發(fā)酵。其次，確定了酶菌協(xié)同發(fā)酵蛋白飼料的最佳工藝條件:發(fā)酵時(shí)間為48h，纖維素酶和酵母菌混合比例為8︰15，料液比為1︰20，培養(yǎng)溫度為35℃。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)品的粗蛋白含量由5.24%上升到29.71%，提高了4.67倍，高于國(guó)家規(guī)定的蛋白飼料中的蛋白質(zhì)含量，比廖學(xué)義等采用木霉與酵母混合發(fā)酵秸稈生產(chǎn)蛋白飼料提高了2倍左右，比張偉心等采用混合菌發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料提高了1.5倍，比王慧杰等采用多種混合菌發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料提高了1.1倍，改善了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。玉米秸稈經(jīng)固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)飼料，既充分利用了農(nóng)業(yè)廢棄物資源，又可緩解蛋白質(zhì)飼料短缺的現(xiàn)狀，本研究結(jié)果為玉米秸稈生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料提供了新思路。
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