復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕生產(chǎn)工藝參數(shù)的優(yōu)化及酶菌聯(lián)合發(fā)酵對豆粕品質(zhì)的影響
豆粕以其良好的營養(yǎng)特性被譽(yù)為植物性蛋白質(zhì)飼料“之王”，成為蛋白質(zhì)資源的首選。然而由于豆粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、植物凝集素、低聚糖和抗原蛋白等限制其使用。近幾年來，國內(nèi)大豆生產(chǎn)量下滑，加之畜牧業(yè)的發(fā)展使對豆粕的需求旺盛，其需求大和資源緊缺的矛盾日益突出，給飼料工業(yè)帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。當(dāng)前，提高豆粕的營養(yǎng)價值和利用效率一直是理論研究和實際生產(chǎn)需求的熱點(diǎn)課題。而利用益生菌進(jìn)行發(fā)酵處理是一條經(jīng)濟(jì)有效的途徑。
益生菌發(fā)酵可將豆粕中大分子蛋白質(zhì)降解為多肽、小肽及游離氨基酸，除去多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，平衡豆粕氨基酸，提高其消化利用率。經(jīng)發(fā)酵處理的豆粕還富含益生菌體、有機(jī)酸和多功能小肽等活性物質(zhì)，能緩解仔豬斷奶應(yīng)激、降低仔豬腹瀉率、改善畜禽胴體品質(zhì)、提高動物生產(chǎn)性能和免疫能力。
當(dāng)前，關(guān)于不同發(fā)酵方式改善豆粕品質(zhì)的研究已屢見不鮮，但絕大部分試驗參數(shù)是基于實驗室小試條件下高料水比發(fā)酵的結(jié)果，與實際大規(guī)模生產(chǎn)需求存在一定差距。另外，傳統(tǒng)豆粕的處理一般采用微生物發(fā)酵或者添加外源蛋白酶酶解2種途徑，而將微生物與蛋白酶聯(lián)合處理豆粕的研究鮮有報道。為此，本試驗?zāi)M實際生產(chǎn)中發(fā)酵料層高度，原料粉碎粒度采用工廠生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)并且不經(jīng)滅菌處理，發(fā)酵用水量設(shè)計在更具經(jīng)濟(jì)價值的低水分區(qū)段，通過篩選出最優(yōu)復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕工藝參數(shù)并進(jìn)一步研究蛋白酶對其發(fā)酵品質(zhì)的影響，以期為實際生產(chǎn)中豆粕資源的高效、低成本利用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1 試驗材料
豆粕，粗蛋白質(zhì)含量為43.36%(實測)，粉碎過3.0篩板;釀酒酵母(Saccharomy cescerevisae)，酵母活菌數(shù)≥2.0×1010個/g，購自安琪酵母股份有限公司;米曲霉(Aspergillus oryzae)，有效孢子含量≥2.0×109個/g，購自百惠生物科技有限公司;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，有效孢子含量≥2.0×1010個/g，購自安琪酵母股份有限公司;發(fā)酵用蛋白酶，有效成分為中性蛋白酶，活性為30000IU/g，購自湖南利爾康生物有限公司。
1.2 試驗設(shè)計
第1步:主要采用對比試驗，涉及發(fā)酵豆粕4個料水比水平(1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6，風(fēng)干基礎(chǔ))在不同發(fā)酵時間段(0、24、48、72h)的變化，每個組3個重復(fù)，各個時間點(diǎn)連續(xù)采樣，在此基礎(chǔ)上通過測定不同時間點(diǎn)的發(fā)酵效果來選擇最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)。第2步:在該推薦發(fā)酵參數(shù)的基礎(chǔ)上設(shè)計加酶試驗組和無酶對照組，通過測定粗蛋白質(zhì)、真蛋白質(zhì)、干物質(zhì)、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和游離氨基酸含量，以研究添加蛋白酶對豆粕發(fā)酵品質(zhì)的影響。
1.3 豆粕發(fā)酵方法
將96%豆粕、2%麥麩和2%玉米粉混合均勻。根據(jù)本課題組前期所做的不同微生物發(fā)酵豆粕的添加量及配比參數(shù)，按原料重的0.5%計算菌粉總添加量，再根據(jù)釀酒酵母∶米曲霉∶枯草芽孢桿菌=5∶1∶2的比例計算各菌粉接種量。發(fā)酵用水按不同料水比計算添加。底物混合均勻后裝入發(fā)酵桶(每桶裝量約30kg)于室溫(28～29℃)下發(fā)酵。
1.4 豆粕發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化
按上述方法混合不同料水比發(fā)酵底物(不添加蛋白酶)，每個料水比做3個重復(fù)，發(fā)酵至72h，期間在0、24、48、72h開蓋，測定物料中心溫度，并每次移取約200g樣品，取3.00g鮮樣測定pH，剩余鮮樣65℃烘干，粉碎過40目篩，陰涼干燥處保存待測其他指標(biāo)。
1.5 添加蛋白酶對發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響
在推薦發(fā)酵參數(shù)下，按照上述方法混合發(fā)酵底物，對照組不加酶，試驗組加酶，根據(jù)蛋白酶使用說明推薦劑量，試驗組蛋白酶添加量為發(fā)酵底物的0.01%，試驗組每組設(shè)3個重復(fù)。發(fā)酵終止時取樣約200g于65℃烘干，粉碎過40目篩，陰涼干燥處保存待測指標(biāo)。
1.6 測定指標(biāo)及方法
用溫度計測定發(fā)酵物料中心溫度，取樣用浸提法結(jié)合pH計測定鮮樣pH，初水分、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照張麗英的方法進(jìn)行測定，游離氨基酸含量參照朱燕等采用的茚三酮顯色法進(jìn)行測定，揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)含量參照朱燕等采用的半微量蒸餾法測定，真蛋白質(zhì)參照胡永娜等采用的三氯乙酸沉淀法測定。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量參考Sadeghi等的方法，采用不連續(xù)SDS-PAGE對發(fā)酵豆粕進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。
1.7 統(tǒng)計分析
試驗結(jié)果使用Excel 2007進(jìn)行預(yù)處理，用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行雙因素方差分析，采用Duncan氏法多重比較檢驗，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(顯著水平為P＜0.05)，SDS-PAGE電泳圖譜使用Banscan(version5.0)軟件分析。
2結(jié)果與分析
2.1 豆粕發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化
由表1可知，發(fā)酵溫度呈先上升后下降的趨勢，各料水比在發(fā)酵24h時均達(dá)到最高溫度，48h發(fā)酵溫度略高于室溫(28～29℃)，而72h發(fā)酵溫度幾乎同于室溫，說明微生物在48h后發(fā)酵作用微弱。其中料水比為1∶0.4時的發(fā)酵溫度在各時間點(diǎn)均為最高值，一定程度上說明其微生物最活躍且持續(xù)時間長。
發(fā)酵過程中pH緩慢下降，料水比為1∶0.4時各時間點(diǎn)的pH總計值顯著低于其他料水比(P＜0.05)，各料水比發(fā)酵72h時的pH總計值顯著低于其他時間點(diǎn)(P＜0.05)。在pH上，發(fā)酵時間與料水比交互作用顯著(P＜0.05)。
發(fā)酵過程中粗蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降趨勢。0h粗蛋白質(zhì)含量在41%左右，48h各料水比組粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，相對于0h分別提高了4.39、5.67、3.90和6.22個百分點(diǎn)，所有組中，以料水比為1∶0.6時發(fā)酵48h的粗蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到47.29%，48h后略有下降。
發(fā)酵過程中真蛋白質(zhì)含量整體呈先上升后下降趨勢，48h各料水比組真蛋白質(zhì)含量均上升到最高，之后略有下降。在真蛋白質(zhì)含量上，發(fā)酵時間和料水比兩因素交互作用顯著(P＜0.05)，其中料水比1∶0.4在發(fā)酵48h條件下真蛋白質(zhì)含量上升最高，達(dá)到43.34%。
發(fā)酵過程中初水分含量呈緩慢升高趨勢，0～24h初水分含量上升明顯，之后變化幅度減小。1∶0.6料水比初水分含量顯著高于其他水平組(P＜0.05)。發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量總體呈先升高后緩慢下降的趨勢，且隨著料水比的增加呈相應(yīng)的梯度增加，其中1∶0.6料水比在發(fā)酵48h時揮發(fā)性鹽基氮含量最高，達(dá)到38.10×10－2mg/g。
綜上所述，隨著料水比的遞增，發(fā)酵豆粕的溫度、pH和真蛋白質(zhì)含量都呈梯度變化，其中料水比1∶0.4組部分發(fā)酵指標(biāo)優(yōu)于其他組。而粗蛋白質(zhì)含量指標(biāo)顯示料水比1∶0.6組最優(yōu)，但其發(fā)酵后揮發(fā)性鹽基氮含量過高，影響發(fā)酵豆粕商品質(zhì)量。另外，1∶0.6料水比發(fā)酵后水分含量過高，極大增加了生產(chǎn)成本。綜合考慮后本試驗選取1∶0.4為推薦生產(chǎn)料水比。就發(fā)酵時間而言，初水分、粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵48h達(dá)到最高，其后又顯著下降。溫度和pH在發(fā)酵48～72h變化幅度減小，說明發(fā)酵48h時微生物作用已很微弱。因此本試驗選取48h作為推薦發(fā)酵時間。
2.2 加酶對豆粕發(fā)酵品質(zhì)的影響
2.2.1 加酶對豆粕發(fā)酵常規(guī)營養(yǎng)成分的影響
由表2可知，與對照組相比，試驗組粗蛋白質(zhì)含量無顯著變化(P＞0.05)，而真蛋白質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05)，游離氨基酸含量提高了0.36個百分點(diǎn)(P＜0.05)，干物質(zhì)含量降低了4.11個百分點(diǎn)(P＜0.05)，粗灰分、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維都略有降低，但差異不顯著(P＞0.05)。
發(fā)酵過程中pH緩慢下降，料水比為1∶0.4時各時間點(diǎn)的pH總計值顯著低于其他料水比(P＜0.05)，各料水比發(fā)酵72h時的pH總計值顯著低于其他時間點(diǎn)(P＜0.05)。在pH上，發(fā)酵時間與料水比交互作用顯著(P＜0.05)。
發(fā)酵過程中粗蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降趨勢。0h粗蛋白質(zhì)含量在41%左右，48h各料水比組粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，相對于0h分別提高了4.39、5.67、3.90和6.22個百分點(diǎn)，所有組中，以料水比為1∶0.6時發(fā)酵48h的粗蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到47.29%，48h后略有下降。
發(fā)酵過程中真蛋白質(zhì)含量整體呈先上升后下降趨勢，48h各料水比組真蛋白質(zhì)含量均上升到最高，之后略有下降。在真蛋白質(zhì)含量上，發(fā)酵時間和料水比兩因素交互作用顯著(P＜0.05)，其中料水比1∶0.4在發(fā)酵48h條件下真蛋白質(zhì)含量上升最高，達(dá)到43.34%。
發(fā)酵過程中初水分含量呈緩慢升高趨勢，0～24h初水分含量上升明顯，之后變化幅度減小。1∶0.6料水比初水分含量顯著高于其他水平組(P＜0.05)。發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量總體呈先升高后緩慢下降的趨勢，且隨著料水比的增加呈相應(yīng)的梯度增加，其中1∶0.6料水比在發(fā)酵48h時揮發(fā)性鹽基氮含量最高，達(dá)到38.10×10－2mg/g。
綜上所述，隨著料水比的遞增，發(fā)酵豆粕的溫度、pH和真蛋白質(zhì)含量都呈梯度變化，其中料水比1∶0.4組部分發(fā)酵指標(biāo)優(yōu)于其他組。而粗蛋白質(zhì)含量指標(biāo)顯示料水比1∶0.6組最優(yōu)，但其發(fā)酵后揮發(fā)性鹽基氮含量過高，影響發(fā)酵豆粕商品質(zhì)量。另外，1∶0.6料水比發(fā)酵后水分含量過高，極大增加了生產(chǎn)成本。綜合考慮后本試驗選取1∶0.4為推薦生產(chǎn)料水比。就發(fā)酵時間而言，初水分、粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵48h達(dá)到最高，其后又顯著下降。溫度和pH在發(fā)酵48～72h變化幅度減小，說明發(fā)酵48h時微生物作用已很微弱。因此本試驗選取48h作為推薦發(fā)酵時間。
2.2 加酶對豆粕發(fā)酵品質(zhì)的影響
2.2.1 加酶對豆粕發(fā)酵常規(guī)營養(yǎng)成分的影響
由表2可知，與對照組相比，試驗組粗蛋白質(zhì)含量無顯著變化(P＞0.05)，而真蛋白質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05)，游離氨基酸含量提高了0.36個百分點(diǎn)(P＜0.05)，干物質(zhì)含量降低了4.11個百分點(diǎn)(P＜0.05)，粗灰分、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維都略有降低，但差異不顯著(P＞0.05)。
2.2.2 SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的結(jié)果
SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的結(jié)果見圖1。
SDS-PAGE電泳圖譜使用凝膠電泳圖譜分析軟件Banscan(version5.0)掃描每個條帶的光密度，并設(shè)定40ku以下為小分子蛋白質(zhì)，40～60ku為中分子蛋白質(zhì)，60ku以上為大分子蛋白質(zhì)。每類蛋白質(zhì)的含量以該類蛋白質(zhì)電泳條帶光密度占其整條泳道光條帶密度的百分?jǐn)?shù)表示。不同處理豆粕蛋白質(zhì)亞基分布情況見表3。
由圖1及表3可知，未發(fā)酵豆粕組大分子蛋白質(zhì)含量為18.25%，發(fā)酵48h后顯著減少，其中加蛋白酶發(fā)酵豆粕組大分子含量顯著低于未發(fā)酵豆粕組和發(fā)酵豆粕組(P＜0.05)，發(fā)酵豆粕組顯著低于未發(fā)酵豆粕組(P＜0.05)。未發(fā)酵豆粕組的中分子蛋白質(zhì)含量顯著高于加蛋白酶發(fā)酵豆粕組和發(fā)酵豆粕組(P＜0.05)，但經(jīng)發(fā)酵的2組之間差異不顯著(P＞0.05)。小分子蛋白質(zhì)含量加蛋白酶發(fā)酵豆粕組顯著高于發(fā)酵豆粕組(P＜0.05)，而發(fā)酵豆粕組顯著高于未發(fā)酵豆粕組(P＜0.05)。
3討 論
3.1 豆粕發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化
發(fā)酵溫度、pH是微生物活躍程度的直接衡量指標(biāo)，由于微生物大量繁殖，各料水比發(fā)酵溫度均在24h時最高，之后隨著底物中可利用碳水化合物等減少，微生物活性逐漸減弱，發(fā)酵溫度緩慢降低。該試驗pH緩慢下降是因為多菌種(不含乳酸菌)發(fā)酵并不會使pH大幅度下降，但較低的pH說明微生物對底物分解更徹底，產(chǎn)生更多的有益代謝產(chǎn)物。
底物初水分含量是一個重要的生產(chǎn)指標(biāo)，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，微生物不斷將底物中的碳水化合物等結(jié)構(gòu)支撐物質(zhì)分解，造成底物稀濕粘連。由于發(fā)酵后水分含量會極大程度增加烘干成本，實際生產(chǎn)中常選用較低的料水比。
粗蛋白質(zhì)含量是發(fā)酵豆粕的重要商品價值指標(biāo)，豆粕經(jīng)微生物處理后蛋白質(zhì)絕對含量不變或略有下降。但由于碳水化合物被分解導(dǎo)致粗蛋白質(zhì)含量相對上升。本試驗4個料水比發(fā)酵48h其粗蛋白質(zhì)含量提高程度較相似發(fā)酵條件下陳中平等采用單一米曲霉發(fā)酵的結(jié)果略高，這可能是由于多菌種比單一米曲霉發(fā)酵能力更強(qiáng)。Zamora等對豆粕發(fā)酵處理后粗蛋白質(zhì)含量由43.4%上升至45.4%，與本試驗結(jié)果較為一致。
真蛋白質(zhì)(酸不溶蛋白)是豆粕蛋白質(zhì)中未被微生物分解的部分以及菌體蛋白，而另一部分經(jīng)微生物分解后形成的小肽、氨基酸及其他非蛋白氮能溶于三氯乙酸中。本試驗中真蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢，這與許多真蛋白質(zhì)含量降低的報道相反，但是與陳京華利用米曲霉發(fā)酵豆粕后真蛋白質(zhì)含量上升程度一致，劉穩(wěn)結(jié)等利用多菌種發(fā)酵豆粕也得到真蛋白質(zhì)含量升高的趨勢。其可能原因是微生物一方面將真蛋白質(zhì)分解為小肽、游離氨基酸和氨氮，另一方面又將這些分解物合成菌體蛋白，加之微生物對干物質(zhì)的消耗，三者相互動態(tài)作用使真蛋白質(zhì)相對含量不穩(wěn)定。本試驗的真蛋白質(zhì)含量先升高可能是由于菌體蛋白的大量合成以及底物中碳水化合物被利用，發(fā)酵后期隨著氨基酸、小肽及非蛋白氮增加，真蛋白質(zhì)含量降低。
本試驗中料水比1∶0.6組發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量和pH指標(biāo)都優(yōu)于料水比1∶0.4組，但由于料水比1∶0.6組揮發(fā)性鹽基氮含量顯著高于其他料水比組，而揮發(fā)性鹽基氮含量反映了發(fā)酵豆粕的氨基酸損失和腐敗程度，該值應(yīng)越低越好，所以選擇1∶0.4為推薦發(fā)酵料水比。本試驗選取48h為推薦發(fā)酵時間，這與Sardjono等研究證明豆粕發(fā)酵48h米曲霉分泌的蛋白酶活性達(dá)到最高水平而后變?nèi)醯慕Y(jié)論一致。
3.2 加酶對豆粕發(fā)酵品質(zhì)的影響
3.2.1 加酶對豆粕發(fā)酵常規(guī)營養(yǎng)成分的影響
微生物對豆粕的發(fā)酵作用主要依賴于其所產(chǎn)生的各種酶，特別是各種蛋白酶。理論上添加外源蛋白酶協(xié)同微生物發(fā)酵豆粕能夠縮短發(fā)酵時間，產(chǎn)生更好的發(fā)酵效果。本試驗選取上述推薦發(fā)酵條件做加酶與不加酶發(fā)酵的對照試驗，結(jié)果顯示加蛋白酶發(fā)酵對豆粕粗蛋白質(zhì)含量影響不顯著，而顯著降低了真蛋白質(zhì)含量和顯著升高了游離氨基酸的含量。這說明加蛋白酶發(fā)酵使豆粕中更多的蛋白質(zhì)降解為酸溶性蛋白。試驗組豆粕的干物質(zhì)含量顯著降低，這可能是蛋白酶對豆粕蛋白的降解為微生物提供了更多小肽、氨基酸等容易利用的氮源物質(zhì)，使微生物生長更旺盛，將更多碳水化合物分解為自身代謝提供碳架和能量。加蛋白酶使發(fā)酵豆粕中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量略有下降但不顯著，這可能是因為豆粕中纖維含量較低，該類發(fā)酵微生物對碳源的利用主要來自于淀粉、多糖等碳水化合物，而對纖維的改造程度不大。
3.2.2 加酶對豆粕發(fā)酵蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的影響
豆粕中主要抗原蛋白包括大豆球蛋白、α－伴大豆球蛋白、β－伴大豆球蛋白和γ－伴大豆球蛋白。其中大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白占大豆總蛋白的70%以上，經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后其條帶顯示未發(fā)酵豆粕組的各抗原蛋白條帶顏色均深于加蛋白酶發(fā)酵豆粕組和發(fā)酵豆粕組。條帶光密度分析結(jié)果顯示加蛋白酶發(fā)酵豆粕組較發(fā)酵豆粕組β－伴大豆球蛋白的α亞基和α'亞基(大分子蛋白質(zhì))含量顯著降低，小分子蛋白質(zhì)含量顯著提高。這說明添加蛋白酶發(fā)酵能夠有效分解豆粕中大分子蛋白質(zhì)，減少抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高其營養(yǎng)價值。
4結(jié) 論
① 利用復(fù)合益生菌( 釀酒酵母∶ 米曲霉∶ 枯草芽孢桿菌= 5∶1∶2) ，模擬工廠生產(chǎn)的發(fā)酵條件，綜合考慮生產(chǎn)成本因素，選取料水比1 ∶ 0.4、發(fā)酵48 h為發(fā)酵豆粕生產(chǎn)的推薦工藝參數(shù)。
② 在推薦發(fā)酵條件下添加外源蛋白酶協(xié)同微生物發(fā)酵可進(jìn)一步改善發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)品質(zhì)，顯著降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，提高發(fā)酵豆粕可利用氮的質(zhì)量。
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