利用沙棘果渣固態發酵生產新型綠色生物飼料的研究

2020-10-12 15:41:29 點擊：

摘要：以沙棘果加工副產物的果渣為主料，采用地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母、白地霉三株菌株混菌固態發酵生產生物飼料。最佳工藝為：沙棘果渣配比40%~70%，菌種配比為1:1:1，物料含水量55%，初始pH值4.5~5.0，接種總量6%，無機氮源尿素添加量3%，培養周期為44~48h。培養物細胞數可達45億個/g以上，粗蛋白質可達39%以上。蛋雞飼喂實驗結果表明，蛋雞日糧中發酵沙棘果渣添加量為4%時，日產蛋率最高，比對照組提高了6.35%，蛋黃色澤也最高，比對照組提高了32.27%，和對照組相比均差異顯著(P

沙棘又名醋柳、酸刺、黑刺，沙棘屬落葉灌木或小喬木。莖、葉、花、果均具珍貴的經濟價值。由于其含有豐富的維生素、多糖、蛋白質、氨基酸、微量元素等營養成分以及黃酮類、甾體類化合物、原花青素、三萜烯類、鞣質、5-羥色胺等生物活性物質,具備藥食同源的特性，在保健品、食品等開發研究方面得到廣泛重視。

隨著沙棘加工產業的發展，沙棘果渣大量產生，極少部分直接進行了動物飼喂，絕大部分直接丟棄沒有充分利用。沙棘果渣是沙棘果榨汁后的殘渣，約占沙棘果鮮重的20%，在動物營養、抗氧化和免疫方面有極大的利用價值。沙棘果渣有兩種，一種是沙棘鮮果榨汁后剔除果核(種子)的果肉果皮殘渣;一種是沙棘種子提取沙棘油后的殘渣。經研究表明，沙棘果渣中依舊含有多種必需氨基酸和微量元素，黃酮的含量甚至會高過沙棘汁和沙棘油中的黃酮。黃酮類化合物是一種很有效的活性氧清除劑和脂質抗氧化劑，具有較強清除自由基的能力，能有效地清除超氧陰離子和羥自由基，因而有很好的抗衰老功能。

沙棘果渣中含有豐富的黃酮、維生素B1、維生素B2、維生素C、維生素E、氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鞣質、糖、三萜及甾體類等成分。國內外大量試驗證明，在雞、豬、牛、羊、兔等畜禽的飼料中加入一定數量的沙棘果渣，可以促進生長，降低發病率，提高肉或蛋的品質，又可以降低飼料成本，是優質而且價格低廉的飼料。沙棘果渣長期飼喂動物安全可靠，無蓄積性毒害，對畜禽的生長、生產性能具有不同程度的促進作用，提高飼料利用率和蛋黃胡蘿卜素含量，并有降低膽固醇，促進免疫器官生長發育，提高機體抗病力的作用，是畜禽極其理想，價廉質優的添加飼料。利用沙棘制品殘渣作為補充飼料，既增加了優質飼料來源，提高了乳、肉、蛋品的數量和質量，又有益于公共衛生，具有顯著的生產效益和社會效益。

本實驗利用固態生物發酵技術，采用地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母、白地霉三株菌株混菌發酵，對沙棘果渣進行固態發酵生產生物飼料的研究，發揮多菌株間的協同作用，降解了果渣本身含有的果膠及纖維素等物質，提高了菌體蛋白含量，并具有益生特性，使以沙棘果渣為主料的發酵料兼具微生態制劑與蛋白飼料雙重功效的綠色生物飼料。

中國農業農村部第194號文件規定從2020年起飼料中全面禁止使用藥物飼料添加劑，飼料端全面禁抗開始，含有活菌制劑的生物飼料必將發揮更加重要的作用。利用沙棘果渣為主料發酵生產生物飼料，減少了資源浪費和環境污染問題，拓展了沙棘果渣綜合利用的新途徑，具有積極的經濟及社會效益。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母、白地霉，均來自遼寧省微生物科學研究院菌種保藏中心。

1.1.2 沙棘果渣

遼寧省建平縣沙棘制品廠提供，原料分析結果見表1。

從表1看出沙棘皮渣、籽渣成分含量有一定差異，但總體差異并不顯著，一般的生產廠家皮渣、籽渣同時產生，故本實驗采用上述2種的等量混合皮渣。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 試管培養基

地衣芽孢桿菌，編號Y-03。LB培養基：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl10g、蒸餾水1000ml、瓊脂粉15g，pH值為7.0。

產朊假絲酵母，編號B-05。麥芽汁培養基。

白地霉，編號S-01。麥芽汁培養基。

1.1.3.2 液體發酵培養基

地衣芽孢桿菌LB培養基（g/l）：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化鈉10g，pH值為7.0。

產朊假絲酵母YPD培養基（g/l）：蛋白胨20g、酵母浸膏10g、葡萄糖20g，pH值為6.5。

白地霉YPD培養基（g/l）：蛋白胨20g、酵母浸膏10g、葡萄糖20g，pH值為6.5。

1.1.4 主要設備

SPH-2102恒溫培養搖床、PHS-3C型酸度計、SPX-450型恒溫培養箱、OLMPUS CX41顯微鏡、KDN-08A定氮儀。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養方法

1.2.1.1 地衣芽孢桿菌

斜面菌種：35℃培養24h。

液體菌種：裝液量為100ml∕500ml，35℃，160r/min搖床培養36h。

1.2.1.2 產朊假絲酵母

斜面菌種：30℃培養48h。

液體菌種：裝液量為100ml∕500ml，30℃，160r/min搖床培養24h。

1.2.1.3 白地霉

斜面菌種：30℃培養48h。

液體菌種：裝液量為100ml∕500ml，30℃，200r/min搖床培養48h。

1.2.2 沙棘皮渣固體發酵培養方法

將培養好的液體菌種按一定接種量接入配好的固體物料中，加入營養鹽，按一定水分含量拌勻，鋪于層架的屜層上，培養前期可上蓋滅菌的濕紗布，控制環境濕度80%左右，30℃恒溫恒濕固態培養，每天通風換氣2~3次，每次20~30min。

1.2.3 蛋雞飼喂實驗

1.2.3.1 實驗動物和日糧組成

實驗選擇60周齡海蘭褐蛋雞2880只，隨機分為6組，每組3個重復，1到5組在基礎日糧中分別添加1%、2%、3%、4%、5%沙棘發酵飼料，對照組飼喂玉米-豆粕型基礎日糧；預試期7d，正式飼喂期35d，實驗期共42d。基礎日糧參照中華人民共和國蛋雞飼養標準配制，其組成及營養水平見表2。

1.2.3.2 飼養管理

采用3階梯式籠養，每組又分上中下三層，預試期7d，按照蛋雞飼養方法正常管理，自由采食、自由飲水，日投料4次，揀蛋2次。

1.2.3.3 測定項目

分別統計日產蛋率、平均蛋重、蛋黃色澤、破損量、軟蛋量、料蛋比、只日采食量等。

1.2.4 測定方法

粗蛋白質測定采用GB/T 6432—94《飼料中粗蛋白測定方法》，粗纖維測定采用GB/T 6434—94《飼料中粗纖維含量的測定方法》，粗灰分測定采用GB/T 6438—92《飼料中粗灰分的測定方法》，粗脂肪測定采用GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定》，細胞數檢測采用生物學活菌計數法，pH值用酸度計測定。蛋黃色澤的測定采用羅氏比色扇比色法（RYCF）。

實驗數據的統計分析采用SPSS16.0軟件對各組數據進行統計分析。

2結果與討論

2.1 沙棘果渣占整個物料配比的確定

設計沙棘果渣的不同配比，按照合適的發酵碳氮比加入其他輔料，加入定量的液體菌種，30℃培養，進行培養情況觀察、培養物活菌細胞數及粗蛋白含量檢測，結果見表3。

從表3結果可以看出，果渣配比超過70%時物料生長明顯變差，說明過高比例的沙棘果渣不利于菌體生長，配比低于40%時生長相對稍差一些，結合細胞數及粗蛋白2個項目指標，果渣配比占整個物料的40%~70%時最適宜，此時發酵料細胞數及粗蛋白均較高，細胞數最高可達44億個/g以上，粗蛋白含量可達39%以上。

2.2 菌種配比對發酵的影響

設計3個菌種的不同配比，總接種量按10%加入，進行培養情況觀察、培養物活菌細胞數及粗蛋白檢測，結果見表4。

從表4可以看出，菌種的不同配比及加入量對發酵料的細胞數及粗蛋白有較大的影響，3個菌種同時加入時，菌體生長最好，三個菌種同時在發酵料中生長，細胞數可達到最大42.61億個/g，粗蛋白可達38%以上。產朊假絲酵母和白地霉對原料無機氮的轉化及菌體蛋白的提高有較大的影響，可以促進無機氮轉化為有機氮，提高菌體蛋白含量。

2.3 培養基水分含量對發酵的影響

設計培養物不同的水分含量，進行培養情況觀察、培養物活菌細胞數及粗蛋白檢測，結果見表5。

從表5可以看出，培養料水分含量為50%~55%時菌體生長情況較好，最適水分含量為55%，此時菌體生長最好，發酵料細胞數及粗蛋白含量均較高。水分含量低于50%時菌體生長變差；高于60%時生長變慢，同時伴隨染雜菌現象。

2.4 培養料初始pH值的確定

設計初始pH值實驗配方，用1mol/l的HCl或1mol/l NaOH調節培養料的起始pH值，對培養料進行生長情況觀察、培養物活菌細胞數及粗蛋白檢測，結果見表6。從表6可知，原料起始pH值對培養的影響較大，最適pH值為4.5~5.0，三個菌種均能生長較好，菌體生長前期既能較快繁殖達到一定菌數，且后期菌體亦生長較好，pH值為5.0時細胞數及粗蛋白含量均較高。pH值較低時菌體生長較慢，細胞數較低，pH值過高菌體前期生長快，但后期易染雜菌，導致生長變差無法檢測。

2.5 接種量的確定

3個菌種按照同樣的比例加入，設計不同的接種總量，對培養料進行生長情況觀察及活菌細胞計數，結果見圖1。

從圖1可見，隨著接種量的增加，發酵料菌體生長速度隨之變快，當接種量達到6%時，達到最佳生長狀態，細胞數最高可達45億個/g以上，隨著接種量的增加，產品細胞數不再明顯增加，物料菌體生長達到穩定狀態，由此可以確定接種量6%為最適接種量。

2.6 無機氮源轉化率實驗

酵母可將培養基中氨態氮的2/3轉化為蛋白質氮，具有較強的轉化無機氮源的能力，以滿足菌體生長發育的需要，提高菌體蛋白的含量。本實驗以尿素作為無機氮源，其添加量及實驗結果見表7。

從表7中可以看出，當尿素添加量為3%時，轉化率最高，達86.01%，同時純蛋白較高，達31.59%，確定尿素添加量為3%時最適宜。

2.7 培養周期的確定

從培養開始，每隔4h取樣一次，測定培養料不同時間的活菌細胞數，見圖2。

由圖2可見，隨著培養時間的延長，產品細胞數隨之增加，至44~48h左右時，細胞數相對穩定，可達45億個/g左右，不再大幅增加，因此培養周期可確定為44~48h。

2.8 對蛋雞生長性能的影響

在蛋雞日糧中添加不同比例的發酵沙棘果渣進行飼喂實驗，分別統計日產蛋率、平均蛋重、蛋黃色澤、破損量、軟蛋量、料蛋比、只日采食量等，實驗結果見表8。

從表8可知，配方中加入2%、3%、4%、5%比例發酵沙棘果渣的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組和對照組相比日產蛋率差異顯著(P<0.05)，Ⅳ組日產蛋率最高，比對照組提高6.35%。蛋黃色澤Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組和對照組相比差異顯著(P

3討論

地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中較具應用潛力的菌種之一。2013年地衣芽孢桿菌被列入到飼料添加劑菌種目錄中，是目前市售較集中的飼料中微生態制劑產品之一。地衣芽孢桿菌可促使機體產生抗菌活性物質、殺滅致病菌，達到調整菌群、治療目的。地衣芽孢桿菌芽孢具有極強的抗逆性，能耐受飼料制粒高溫、擠壓與干燥，以及原料中的無機鹽、酸化劑及部分抗生素等因素對其的殺滅作用，故成為飼料與養殖過程中應用最廣泛的益生菌之一。產朊假絲酵母又名產朊圓酵母或食用圓酵母，被美國食品及藥物管理局（FDA）認證為可作為食品添加劑的酵母，也是我國衛生部規定的可用于保健食品的真菌菌種。產朊假絲酵母具有較強的轉化無機氮為有機氮的能力，并且在其發酵過程中會產生大量的生物活性物質。產朊假絲酵母能夠生成富含蛋白質、核苷酸、促生長因子、多種酶類及多族維生素類的菌體蛋白，同時作為一株益生菌，具有調節動物腸道微生態平衡，抑制有害菌生長，促進機體生長的作用。能夠刺激反芻動物瘤胃生成大量有益微生物，調控其胃腸菌群環境，增強機體免疫力。

白地霉又叫乳內孢霉，是類似于酵母的地霉屬真菌，繁殖力強，對營養要求粗放，細胞較大而易于回收，含50%蛋白質。細胞富含蛋白質、脂肪、維生素和核酸，可作良好的蛋白質飼料。白地霉可以將有機廢水廢物中的殘糖、有機酸、蛋白質、脂肪酸等轉化為動物可以吸收利用的單細胞蛋白質，同時其他微生物的加入也可以加速白地霉的轉化速率、豐富發酵產品中的營養成分，提升飼料的營養與經濟價值。白地霉體內可以合成纖維素酶，可以降解利用飼料原料中的纖維素。

微生物繁殖過程中可產生有機酸（如乳酸），降低果渣pH值，增加果渣酸香味；果渣的微生物發酵過程中，微生物一方面促進飼料中無機氮向有機氮的轉化，另一方面也加強了對纖維素、脂肪等營養物質的利用，轉化為自身繁殖所需的蛋白質，從而增加果渣中CP含量。此外沙棘果渣含有較高的黃酮及多酚類抗氧化物質，這使其產品在抗氧化和自由基清除及提高機體免疫力方面能夠發揮其更加獨有的作用。本飼喂實驗結果表明發酵沙棘果渣能夠提高蛋雞的生產性能，特別是雞蛋的品質得到了提高，蛋黃顏色明顯增加，分析原因是沙棘果渣含有豐富的胡蘿卜素和類胡蘿卜素，其中胡蘿卜素為15mg/kg，類胡蘿卜素為70mg/kg，還含有沙棘油18%~23%，從而提升了雞蛋的品質及營養價值。

4結論

以沙棘果加工副產物的果渣為主料，采用地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母、白地霉三株菌株混菌固態發酵生產生物飼料。其中沙棘果渣配比40%~70%，菌種配比為1：1：1，物料含水量55%，初始pH值4.5~5.0，接種總量6%，無機氮源尿素添加量3%，培養周期為44~48h。培養物細胞數可達45億個/g以上，粗蛋白質可達39%以上。

蛋雞飼喂實驗結果表明，蛋雞日糧中添加發酵沙棘果渣對蛋雞的生產性能有顯著的影響。添加量為4%時，日產蛋率最高，比對照組高6.35%，蛋黃色澤也最高，比對照組高32.27%，和對照組相比均差異顯著(P

以沙棘果渣為主料，利用地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母、白地霉三株菌株混菌固態發酵培養生物飼料，采用固態發酵技術法生產，工藝簡單可行，操作性強。產品活菌細胞數較高，粗蛋白含量大幅提高。同時沙棘果渣本身豐富的微量元素及維生素等有益成分，使其具有更加獨特的飼喂效果，產品兼具微生態制劑及蛋白飼料的雙重特性，是一種新型的綠色生物飼料。

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