不同蛋白酶對豆粕抗原蛋白降解程度的研究表明經(jīng)過發(fā)酵乳酸含量高，有益動物腸道健康，節(jié)約成本

2021-12-29 11:03:46 點(diǎn)擊：

摘要：為提高豆粕蛋白質(zhì)利用率和動物生產(chǎn)性能，分析了不同來源的蛋白酶對豆粕中抗原蛋白（大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白）含量的影響，將經(jīng)過蛋白酶處理的豆粕進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測分析。結(jié)果表明，同等酶活的不同蛋白酶對豆粕中的抗原蛋白降解程度有較大差別。經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終選擇酸性蛋白酶、中性蛋白酶、乳酸菌和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵方式，最終使得發(fā)酵豆粕乳酸含量達(dá)到2.76%，酸溶蛋白含量14.76%，大豆球蛋白含量降低至25.3 mg/g。

豆粕作為優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白質(zhì)，是目前飼料工業(yè)應(yīng)用最廣泛的原料之一。豆粕的氨基酸組成較為合理，可滿足動物營養(yǎng)需要，但存在抗?fàn)I養(yǎng)因子種類多、含量高的缺陷，使得其作為動物飼料的消化利用率偏低，造成浪費(fèi)的同時也引起腹瀉等諸多的動物疾病。其中大豆球蛋白（Glycinin）和 β-伴大豆球蛋白（β-congly⁃cinin）這兩種抗原蛋白致敏性最強(qiáng)，占大豆總蛋白的65%以上。因此，如何降低飼料的抗原蛋白從而提升豆粕利用價值是飼料企業(yè)和養(yǎng)殖者亟需解決的問題。

抗原蛋白可以通過微生物發(fā)酵及利用蛋白酶酶解進(jìn)行消除。實(shí)際生產(chǎn)中往往兩者同時進(jìn)行。蛋白酶制劑主要根據(jù)其最適pH值分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶。盡管豆粕的pH值在6.4~6.8的近中性范圍，但在微生物發(fā)酵過程中發(fā)酵豆粕的pH值逐漸降至4.5~5之間。另外在微生物發(fā)酵過程中的體系溫度也與酶制劑的最適溫度有差異。因此，選用適于微生物發(fā)酵條件的酸性蛋白酶及中性蛋白酶，并調(diào)節(jié)二者的劑量比例對提升發(fā)酵豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效率十分重要。本研究通過調(diào)研部分市售蛋白酶產(chǎn)品，檢測其在微生物發(fā)酵條件下對豆粕抗原蛋白的降解能力，為工業(yè)生產(chǎn)過程中挑選適合的發(fā)酵劑提供參考。

1、材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

46% 豆粕；

MRS 培養(yǎng)基及 LB 培養(yǎng)基；

大豆球蛋白定量測定試劑盒；

其他化學(xué)試劑，

植物乳桿菌 GJ25 及枯草芽孢桿菌BS01均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

通過市場調(diào)研，分別采購 12 種市售酸性及中性蛋白酶，廠家信息略。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 檢測酸性蛋白酶降解豆粕抗原蛋白

根據(jù)市售發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的實(shí)際情況，在利用酸性蛋白酶降解抗原蛋白時，體系中添加 2% 的乳酸。即分別在 200 ml 無菌水中加入稱取的 0.2 g 酶制劑（50 000 U/g）及 2 g 乳酸，混勻后加入到 100 g 豆粕中，攪拌均勻后置于 37 ℃恒溫 24 h，酶解完成后按王寅等報道的方法提取蛋白質(zhì)，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化。

1.2.2 檢測中性蛋白酶降解豆粕抗原蛋白

由于豆粕的pH值為6.5左右，因此無額外條件更改。即分別在200 ml無菌水中加入稱取的0.2 g酶制劑（50 000 U/g），混勻后加入到 100 g豆粕中，攪拌均勻后置于 37 ℃恒溫 24 h，發(fā)酵完成后提取蛋白質(zhì)，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化。

1.2.3 蛋白酶解與微生物發(fā)酵同時進(jìn)行的情況分析

接種 GJ25乳酸菌種子于 MRS培養(yǎng)基，37 ℃過夜靜置培養(yǎng)，使其活菌數(shù)達(dá)到 1×109 CFU/ml 以上；接種BS01枯草芽孢桿菌種子于LB培養(yǎng)基，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，使其活菌數(shù)達(dá)到1×106CFU/ml以上。以上兩類菌液各取 1 ml 加入到 200 ml 無菌水中，按試驗(yàn)比例（酸性蛋白酶與中性蛋白酶的比例為10 ：1、5 ：1、1 ：1、1 ：5、1 ：10）稱取不同質(zhì)量的兩類蛋白酶并接入水中，保證兩種蛋白酶酶活總值為 50 000 U/g，稱取混合酶制劑的質(zhì)量為 0.4 g。充分混合后加入到 100 g豆粕中，攪拌均勻后置于 37 ℃恒溫 48 h，發(fā)酵完成后提取蛋白質(zhì)，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化，從而選出最優(yōu)酶制劑比例。

1.2.4 發(fā)酵時間的確定

按照所選擇的酶制劑比例重復(fù)進(jìn)行 1.2.3節(jié)的試驗(yàn)，并在0、1、3、16、24、48、72 h取樣并提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行電泳檢測并利用膠圖分析軟件UVP-VisionWorks對電泳結(jié)果中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的條帶進(jìn)行定量分析：將未經(jīng)處理的豆粕對照樣品中的對應(yīng)條帶設(shè)定為 100%，計(jì)算其他各試驗(yàn)組相關(guān)條帶的相對含量，從而挑選出最合適的發(fā)酵時長。

1.2.5 乳酸含量測定

取 10 g樣品，加入 100 ml煮沸過的去離子水，振蕩溶解10~20 min，取樣離心取上清，利用生物傳感分析儀（型號SBA-40E，）測定乳酸含量并換算樣品中乳酸含量。

1.2.6 大豆球蛋白含量測定

利用大豆球蛋白定量測定試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.7 粗蛋白含量測定

依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗蛋白的測定，凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018）進(jìn)行測定。

2、試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同酸性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白降解效果的比較

利用不同酸性蛋白酶對豆粕進(jìn)行處理，通過對其產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳檢測各酸性蛋白酶對豆粕中兩類抗原蛋白的降解效果，結(jié)果如圖1所示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下(試驗(yàn)方法1.2.1)，各酸性蛋白酶酶制劑對豆粕的抗原蛋白降解程度具有差異，5號酸性蛋白酶在此條件下對抗原蛋白降解效率較高，其工作濃度為0.2%(m/m)。

2.2 不同中性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白降解效果的比較

利用不同中性蛋白酶對豆粕進(jìn)行處理，通過對其產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳檢測各中性蛋白酶對豆粕中兩類抗原蛋白的降解效果，結(jié)果如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下(試驗(yàn)方法1.2.2)，各中性蛋白酶酶制劑對豆粕的抗原蛋白降解程度具有差異，5號中性蛋白酶在此條件下對抗原蛋白降解效率較高，其工作濃度為0.2%(m/m)。

2.3 不同蛋白酶配比劑量對豆粕抗原蛋白降解程度的比較

將上文挑選出的兩種蛋白酶按照如圖 3 所示的質(zhì)量比例進(jìn)行混合，在微生物存在條件下（試驗(yàn)方法1.2.3，GJ25 及 BS01 在達(dá)到菌液濃度要求后,每 100 g豆粕添加1 ml菌液）發(fā)酵48 h后提取蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖3。

通過膠圖分析軟件UVP-VisionWorks對圖3(a)中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的條帶進(jìn)行定量分析，并將未經(jīng)處理的豆粕對照樣品中的對應(yīng)條帶設(shè)定為100%，計(jì)算其他各試驗(yàn)組相關(guān)條帶的相對含量，得到圖3(b)的結(jié)果。結(jié)果顯示，酸性蛋白酶與中性蛋白酶的混合作用可降解豆粕中大于60%的兩類抗?fàn)I養(yǎng)因子。其中，酸性蛋白酶與中性蛋白酶的比例在1：1至1：5內(nèi)降解效果達(dá)到最優(yōu)，最終確定比例為1：1時較為合理，兩者工作濃度均為0.2%。

2.4 發(fā)酵時間的確定

利用 5 號酸性蛋白酶與 5 號中性蛋白酶 1：1 配比的酶制劑，在微生物存在條件下（試驗(yàn)方法1.2.4）對豆粕進(jìn)行處理，在72 h內(nèi)不同時間點(diǎn)采集樣品并進(jìn)行對應(yīng)的電泳檢測，結(jié)果如圖4。

圖4可見，豆粕中兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解效果隨時間增長而提高，在 48 h時達(dá)到最高，與 72 h發(fā)酵效果無明顯差異，因此選定利用上文所述兩種酶制劑1 ：1配比的菌酶協(xié)同發(fā)酵時間為48 h。

2.5 發(fā)酵效果評價

依據(jù)上述結(jié)果，參考本試驗(yàn)所用條件（試驗(yàn)方法1.2.3 及 1.2.4）最終確定了發(fā)酵條件為：5 號酸性蛋白酶0.2%，5號中性蛋白酶0.2%，1%（v/m）枯草芽孢桿菌BS01（菌液濃度為1×106 CFU/ml），1%（v/m）植物乳桿菌 GJ25（菌液濃度為 1×109 CFU/ml），發(fā)酵時間 48 h。對在該條件下得到的發(fā)酵豆粕進(jìn)行部分指標(biāo)測定，結(jié)果如表1所示。

表1結(jié)果表明，本文確定的發(fā)酵劑及發(fā)酵條件下，發(fā)酵豆粕的粗蛋白及其中酸溶蛋白含量較高，提示其營養(yǎng)價值高。大豆球蛋白含量較低，提示該產(chǎn)品對豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果較好。產(chǎn)品pH值較低，乳酸含量較高可幫助維持動物腸道環(huán)境。另外，該產(chǎn)品還對水蘇糖和棉籽糖兩類抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果明顯。

3、討論

發(fā)酵豆粕是解決豆粕在動物飼喂過程中消化利用率低下的重要手段之一，生產(chǎn)發(fā)酵豆粕需要根據(jù)原料特點(diǎn)選擇適合的條件及發(fā)酵劑。目前發(fā)酵豆粕生產(chǎn)所采用的發(fā)酵劑包含酶制劑和微生物。其中針對蛋白質(zhì)降解起主要作用的是蛋白酶制劑。目前市

場上酶制劑種類繁多，但是大部分酶制劑的最適條件與實(shí)際生產(chǎn)條件存在差異。在對酶制劑進(jìn)行選擇的時候不能僅憑酶活力大小作為判斷依據(jù)，而應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注針對目標(biāo)底物的特異性效果。

本試驗(yàn)針對降解豆粕中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子大豆球蛋白及 β-伴大豆球蛋白這一目的，從挑選在非最適條件下適于降解豆粕的酶制劑入手，通過調(diào)整菌劑及酶制劑的配比，實(shí)現(xiàn)了較小成本下生產(chǎn)具有較高品質(zhì)的發(fā)酵豆粕。依據(jù)蛋白酶制劑的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T23527—2009），固體蛋白酶產(chǎn)品的活力單位定義為：1 g固體酶粉，在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生 1 μg 酪氨酸，即為一個酶活力單位，以U/g 表示。在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過程中，為保證益生菌的增殖及活性，其發(fā)酵過程中的溫度變化及 pH 值變化很難保證蛋白酶處在其最適條件。因此酶制劑產(chǎn)品所標(biāo)示的酶制劑活力并不能反映出其對不同底物如豆粕中大豆蛋白的降解程度。本研究結(jié)果表明，不同來源的酶制劑在酪蛋白水解能力一致的條件下，針對特定原料豆粕的降解效果存在差異。同時中性蛋白酶對豆粕的降解起到更主要的作用，這一結(jié)果也同前人研究結(jié)果一致，綜合考慮成本因素和豆粕降解效果，本研究最終確定了上述酶制劑配比比例及發(fā)酵條件。需要說明的是，由于是隨機(jī)盲選，酸性蛋白酶和中性蛋白酶的最優(yōu)組編號均為 5號，但是兩者并不來自同一廠家。另外，本試驗(yàn)所用豆粕均為自然顆粒大小，沒有經(jīng)過粉碎處理，也沒有滅菌處理，這些條件也是考慮到目前大部分發(fā)酵豆粕生產(chǎn)廠家的實(shí)際情況，盡量簡化發(fā)酵的條件控制，具體發(fā)酵條件在實(shí)際生產(chǎn)中也可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行微調(diào)。同時，本研究針對特定原料進(jìn)行酶制劑篩選的思路和方法，也為實(shí)際生產(chǎn)中如何選擇合適的發(fā)酵劑產(chǎn)品提供了新的參考方案。

4、結(jié)論

本研究通過對酶制劑及酶制劑配比進(jìn)行篩選，確定了菌酶協(xié)同發(fā)酵中一套最適的發(fā)酵條件，適合發(fā)酵豆粕生產(chǎn)。得到的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品中，粗蛋白含量50.86%，酸溶蛋白 14.76%，大豆球蛋白 25.3 mg/g，pH 值 4.5，乳酸含量 2.76%，水蘇糖含量 0.017%，棉籽糖含量 0.082%。該產(chǎn)品抗?fàn)I養(yǎng)因子低、乳酸含量高，是有益動物腸道健康的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品，并能較大程度節(jié)約成本。

豆粕發(fā)酵方法

1.準(zhǔn)備優(yōu)質(zhì)豆粕1噸、99多功能飼料發(fā)酵劑1-2包（500克，市場售價25元左右，第一次制作和低溫季節(jié)使用量大）、多糖性復(fù)合菌種培養(yǎng)基5公斤。

2.先將多糖性復(fù)合菌種營養(yǎng)基融入低于45℃的溫水中再加入99多功能飼料發(fā)酵劑發(fā)酵劑，2小時以上后再與上述其它物料混合均勻后將含水量調(diào)節(jié)到50%-60%（手捏一把成團(tuán)且沒有水滴下為宜），本方法也用于發(fā)酵菜粕、棉粕脫毒代替豆粕。

3.最后壓實(shí)密封裝袋發(fā)酵7-10天即可打開使用，打開使用時切記要重新密封好，防止雜菌進(jìn)入造成發(fā)霉。

密封發(fā)酵中的豆粕

多糖性復(fù)合菌種營養(yǎng)基產(chǎn)品說明書

本產(chǎn)品是針對復(fù)合微生物制劑產(chǎn)品（益生菌、菌種）進(jìn)行激活、擴(kuò)培、發(fā)酵等針對性設(shè)計(jì)的專用營養(yǎng)包（培養(yǎng)基），以菌種更喜歡的“食物”高濃度糖蜜為主要原料，再科學(xué)地添加氮源等原料，形成菌種“食物的全價飼料”，讓激活、培養(yǎng)、擴(kuò)培的菌種更健壯與密度更大，讓發(fā)酵飼料效果與質(zhì)量更好，讓直接添加的益生菌產(chǎn)生效果更快更好。且運(yùn)用成本低廉，本品1公斤使用效果多項(xiàng)指標(biāo)比添加3公斤紅糖、葡萄糖、白糖效果更好。在制作發(fā)酵飼料時本品1公斤可以直接代替20公斤左右的玉米粉等且在許多參數(shù)上發(fā)酵效果更好更快更香醇。

本產(chǎn)品符合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

【適用對象】畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖，環(huán)保

【原料組成】多糖性糖蜜、植物性蛋白胨、酵母膏、微量元素、維生素等。

【產(chǎn)品成分分析保證值】本品為黏稠液體，總糖分（蔗糖分+還原糖分）≥48%。

【產(chǎn)品特點(diǎn)】

1.本品為運(yùn)用在畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖上、環(huán)保上經(jīng)常使用的復(fù)合微生物（菌種）生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料，含有微生物（菌種）所必需的碳源、氮源、微量元素、生長素等。

2.本品運(yùn)用高濃度甘蔗糖蜜為主要原料，輔以低聚糖（益生元）等復(fù)合菌種所需的營養(yǎng)而設(shè)計(jì)，因此制作出的菌種健壯與密度更大、發(fā)酵飼料等氣味甜香濃郁，對飼養(yǎng)動物而言適口性更好。

【產(chǎn)品使用方法】

一、制作加強(qiáng)型EM菌液上的使用

將本品先溶于5倍以上的溫水中（溫度不超過45℃），再另外添加菌種和實(shí)際用水量（按照EM菌種的產(chǎn)品說明書），按照本品1公斤代替約3公斤紅糖的使用量，當(dāng)然也可以少量另外添加少量紅糖或者適當(dāng)增加本品的使用量效果更好。

二、激活多種復(fù)合菌種的使用方法

將本品溶于少量低于45℃的溫水中后再放入需要激活的菌種，然后再加入適量的水。適當(dāng)增加本品的使用量會增加菌種的健壯程度與密度，且保存的時間也可以更長。本品1公斤可以兌水50公斤以上適合激活各種需要激活的復(fù)合菌種，廣泛運(yùn)用包括糞污處理菌種激活、環(huán)保處理菌種激活、動物飲水復(fù)合益生菌激活后使用等運(yùn)用上。

三、發(fā)酵飼料制作上的使用

先將本品融入低于45℃的溫水中再加入發(fā)酵劑，2小時以上后再與飼料混合，能夠大幅度提高發(fā)酵飼料的速度、質(zhì)量、營養(yǎng)和適口性（包括青貯飼料），每噸發(fā)酵飼料添加本品推薦在750克以上，原則上本品使用量越大效果越好。本品1公斤可以代替20公斤左右的玉米粉制作發(fā)酵飼料且發(fā)酵效果更好更快更香醇（包括青貯飼料），運(yùn)用本品后可以減少或不使用玉米粉，顯著降低發(fā)酵飼料制作成本。

四、配合畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌使用

先將本品融入低于45℃的溫水中，再將運(yùn)用在畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖上的益生菌（不管是水劑還是粉劑）溶于其中2小時以上進(jìn)行活化再使用（直接拌料或者飲水中添加），將可以明顯提高使用效果。使用量按照每噸飼料或飲水使用本品200克以上進(jìn)行，活化后要求在72小時內(nèi)使用完。此項(xiàng)操作也適合動物因?yàn)閾Q欄等因素導(dǎo)致的應(yīng)激，能夠讓動物快速恢復(fù)食欲，減少腸道健康等問題。

五、改善草料、青料等適口性

稀釋后（至少30倍）灑入一些動物飼料上（如草料、青綠飼料、適口性差的飼料等）能夠明顯改善采食量，提高營養(yǎng)和吸收等，稀釋時加入對應(yīng)動物的益生菌效果更好。

六、其它方面的使用

在畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖上，可以將本品作為特殊的甜味劑，改善因?yàn)樘砑幽承┧幬飳?dǎo)致適口性差動物不吃的問題；直接將本品溶解稀釋后灑入水產(chǎn)養(yǎng)殖水域能夠促進(jìn)微生物繁殖；灑入糞污處理中能夠促進(jìn)發(fā)酵等；灑入采用微生物處理的污水中能夠加快處理速度等效果。

發(fā)酵豆粕的好處

1. 發(fā)酵豆粕徹底去除了大豆抗原和抗?fàn)I養(yǎng)因子，解決幼齡動物的營養(yǎng)性腹瀉問題；
2. 低溫烘干或直接飼喂的濕潤狀態(tài)的發(fā)酵豆粕具有乳酸菌等益生菌功能，顯著提高動物的健康水平，減少畜禽舍氨味臭味，提高飼料報酬；
3. 具有酸化劑的功能，可酸化腸道，激活幼齡動物消化酶活性，抑制有害細(xì)菌；
4. 含較高的活性小肽，可以通過腸道粘膜直接吸收，吸收耗能低，并顯著提高植物蛋白的利用率；
5. 發(fā)酵后的豆粕適口性好，提高動物食欲，促進(jìn)消化吸收，增進(jìn)健康水平。

使用對象及用法用量

添加比例可以依據(jù)飼養(yǎng)對象、飼養(yǎng)階段和生理狀態(tài)的不同需求（泌乳，抗應(yīng)激，促生長等），決定使用量：

1、全部替代乳清粉、代乳粉；

2、全部替代魚粉，且無組胺、無肌胃糜爛素；無高酸價；無高過氧比值；

3、全部取代腸膜蛋白粉及40%的血漿蛋白粉，且無病菌污染的危險；

4、優(yōu)于豆粕等所有的植物性蛋白源。

動物用量：乳豬10%-25%；中大豬5%-8%；種蛋禽10%-20%；淡水魚5%-15%；仔豬5%-15%；哺乳母豬5%-10%；肉小禽5%-10%；鱖鱉海水魚10%-20%；懷孕母豬5%-8%；牛羊5%-15%；蝦蟹鰻10%-25%。

【視頻】部分發(fā)酵飼料養(yǎng)雞效果好，節(jié)約飼料雞場不臭肉質(zhì)好

綜上所述，發(fā)酵豆粕作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)飼料，可改善大豆的營養(yǎng)品質(zhì)，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原蛋白的水平，且富含生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)生長、增強(qiáng)免疫力和抑制消化道疾病、減少抗生素用量等功能，這對斷奶仔豬而言十分重要，并有利于豆粕的高效利用，對緩解我國優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的不足、減少對動物蛋白質(zhì)飼料的依賴及降低生產(chǎn)成本等具有重要意義。

多糖性復(fù)合菌種營養(yǎng)基，大幅度提高菌種活性與使用效果，降低發(fā)酵飼料成本與提高品質(zhì)

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