發酵飼料對中華絨螯蟹幼蟹生長、抗氧化、免疫和蛋白代謝的影響
中華絨螯蟹是我國重要的經濟型蟹類之一，主要分布于渤海、黃海和東海沿岸各省市。因為中華絨螯蟹味道鮮美，營養豐富，深受廣大消費者喜愛，使其市場需求量與日俱增，養殖業得以蓬勃發展。2016 年我國中華絨螯蟹的養殖產量就已達到了81 萬噸，也因此產生了巨大的飼料資源需求。然而我國優質飼料原料缺乏，長期存在一定飼料安全性等問題，制約了我國畜牧業的持續穩定發展。采用創新技術，利用新型飼料資源，提高可持續性，擴大養殖效益已成為了當務之急。
生物發酵飼料是指利用一些特種功能性微生物與常規的飼料原料及輔料混合后發酵，最終制成的含有一定量活性益生菌的、安全無污染的飼料。生物發酵飼料原料來源廣泛，成本低廉，同時具備抗營養因子低、易于消化吸收、促進動物生長、增強動物免疫能力等眾多優點，完全符合當前我國養殖業綠色發展的需求。目前眾多科研工作者也對發酵飼料在水產養殖中的應用展開了研究。李小梅等使用發酵豆粕替代魚粉投喂凡納濱對蝦，Dossou 等在飼料中使用發酵菜籽粕代替部分魚粉飼喂紅鯛，均觀察到增重率顯著提高，餌料系數下降。但是，關于發酵飼料在中華絨螯蟹上的研究仍然較少且不夠深入全面，使得發酵飼料在中華絨螯蟹飼料中使用時缺乏足夠的參考。
一些研究已經證明，飼料經過芽孢桿菌發酵后，其中含有了高活性的蛋白酶和一定抗氧化能力的活性肽；乳酸桿菌加入飼料中可以抑制有害細菌的生長，同時，飼料經過乳酸桿菌發酵后可以改善適口性；利用酵母菌發酵飼料，除了可以提高動物對干物質和中性洗滌纖維的消化率外，還可以有效促進動物生長，提高動物免疫力。因此，本試驗采用的發酵飼料是選用玉米、豆粕等飼料原料作為發酵底物，接種芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等活性益生菌，采用好氧、厭氧的深度發酵技術，經過嚴格發酵過程管控，獲得豐富的代謝產物和有益菌組成。研究其在配合飼料基礎上額外配伍不同量發酵飼料，投喂中華絨螯蟹幼蟹，從生長表現、抗氧化能力、免疫能力和蛋白代謝等多方面入手，探討發酵飼料對中華絨螯蟹幼蟹生長性能和生理生化指標的影響，以求為發酵飼料在中華絨螯蟹飼料中的應用提供參考依據。
1 材料與方法
1.1 試驗飼料
試驗所用的發酵飼料由南京寶輝生物飼料有限公司提供，該發酵飼料采用玉米、豆粕等優質原料作為發酵底物，接種芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等高活性益生菌種，采用多菌種多底物好氧+厭氧深度發酵技術制備。經測定，其主要營養指標如下：粗蛋白（以干物質計）≥23.0%；粗脂肪（以干物質計） ≥2%；粗纖維（ 以干物質計） ≤6%；粗灰分（ 以濕品計）≤5.0%；酸溶蛋白（ 占百分比）≥25.0%；總酸（以乳酸含量計，以濕品計）≥3.0%；pH 值≤4.5；水分含量（占百分比）≤45.0%。配合飼料購自江蘇海普瑞飼料有限公司。對照組投喂配合飼料，命名為F0；此外，設置四組試驗組，每組在日投喂量基礎上額外配伍日投喂量5%、10%、15%和20%的發酵飼料，并將各試驗組依次命名為F5，F10，F15，F20。
配合飼料營養組成見表1
1.2 試驗蟹與養殖管理
試驗所用的中華絨螯蟹選自南京市浦口區的一個養殖池塘中，養殖試驗在南京市浦口區星甸鎮南京農業大學水產試驗基地的室外白皮桶中進行。在飼養試驗開始之前，幼蟹要暫養在白皮桶中兩周，以適應白皮桶的養殖環境和飼料投喂的養殖模式。試驗共使用了150 只大小均一，體質健康，螯足健全的河蟹（平均初始體重1.01±0.16 g），將他們按公母比例1:1 隨機分為5 組，每組設置3 個重復，每個重復為10 只河蟹，養殖于15 個白皮桶中（2×1.2×0.5 m，長:寬:高）。每個白皮桶中設置8 根PVC 管和適量的水葫蘆，以供河蟹躲避，防止相互殘殺。在整個試驗期間，白皮桶中持續充氣，定期換水1/3，每天監測水溫、pH 和溶解氧，并控制在24±5 ℃、8.0~8.6、5 mg/L。
正式養殖試驗持續了59 d，直到幾乎所有的河蟹都完成了兩次脫殼，試驗才停止。在飼養過程中，每天喂食一次（17: 00），飽食投喂。投喂飼料的量根據天氣和飼養環境進行適當的調整，確保在投喂3 小時后不留下餌料。每天觀察各組蟹的攝食、殘餌、死亡情況，做好詳細記錄以備分析。
我們保證所有有關于活蟹實驗的協議都遵守南京農業大學愛護與使用實驗動物的道德指導。本研究由南京農業大學動物保護與利用委員會批準（許可證號: SYXK （Su） 2011-0036）。
1.3 樣品采集與分析測定
1.3.1 樣品采集
采樣前，所有河蟹饑餓處理48 h，依次測量每只河蟹的體重，用來計算增重率（WGR）和特定生長率（SGR）。然后從每個白皮桶中隨機選擇三只河蟹進行取樣。每只蟹抽取等量血淋巴用于指標測定。血淋巴抽取后立刻在4 ℃下3500 r/min 離心10 min，接著立刻吸取上層清液裝入離心管中保存于-20 ℃，用于后期抗氧化和免疫酶活性的測定。最后在無菌環境下完全采集了河蟹的肝胰腺并稱重，全部裝入凍存管中保存于-20 ℃，用于后期蛋白代謝酶活性的測定。
1.3.2 生長指標及計算方法
蟹生長相關指標：增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、存活率（SR）、肝體比（HSI）的計算公式如下：
增重率（WGR，%）=(W1-W0)/W0×100
特定生長率（SGR，%）=(LnW1-LnW0)/D×100
存活率（SR，%）=N1/N0×100
肝體比（HIS，%）=W2/W3×100
式中W0 為蟹的初始體質量（g），W1 為終末體質量（g），D 為試驗養殖的天數（d），N0 為試驗開始時河蟹的數量（只），N1 為試驗結束時河蟹的數量（只），W2 為肝胰腺的重量（g），W3 為相應河蟹的重量（g）。
1.3.3 血淋巴抗氧化指標測定
各酶活測定采用南京某科技有限公司提供的試劑盒。脂質過氧化物（LPO）的測定方法是在45 ℃溫度下，一共反應60min，一分子LPO 會和兩分子的顯色劑反應，最終產生了穩定的生色團，它在568 nm 下有最大吸收峰，使用標準曲線公式計算吸光度值得到檢測物中LPO 的含量；過氧化氫酶（CAT）的測定方法為鉬酸銨可迅速中止CAT 分解過氧化氫的反應，加入鉬酸銨后，未反應的過氧化氫與鉬酸銨反應產生淡黃色的絡合物，然后在405nm 處測定吸光度的變化量，就可以計算出CAT 的活力；總抗氧化能力（T-AOC）的測定方法是根據抗氧化物存在時，ABTS 生成ABTS+的過程會被抑制，只需要測定405 nm 處ABTS+的吸光度值就能計算出樣品的總抗氧化能力（T-AOC）。
1.3.4 血淋巴免疫指標測定
血淋巴中的酸性磷酸酶活性、總蛋白含量和白蛋白含量的測定均使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。酸性磷酸酶（ACP）的測定是根據ACP 能將磷酸苯二鈉分解為游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中可以和4-氨基安替吡啉反應，最后被鐵氰化鉀氧化，生成了紅色的醌衍生物，根據紅色的深淺就能測定ACP 酶活性的高低；總蛋白含量的測定是利用在堿性條件下，蛋白能將Cu2+還原，而Cu與BCA 試劑反應形成了紫色絡合物，在562 nm 有最大吸收峰，吸光度值和濃度成正比關系，因此只需要測吸光度即可進而計算出待測蛋白的濃度；白蛋白采用溴甲酚綠比色法。球蛋白含量=總蛋白-白蛋白，白球比=白蛋白/球蛋白×100。
1.3.5 肝胰腺蛋白代謝酶活性測定
測定胰蛋白酶、胃蛋白酶、Na+，K+-ATP 酶、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的試劑盒均購自南京某科技有限公司。為測定肝胰腺中的胰蛋白酶、胃蛋白酶、Na+，K+-ATP 酶、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活性，需要首先取樣品在9 倍體積的生理鹽水中勻漿，然后在離心機上，4 ℃條件下，5000 r/min離心15 min，最后取出中層清液用于酶活性的測定。
肝胰腺中胰蛋白酶活性的測定的原理是利用胰蛋白酶能催化水解精氨酸乙酯的酯鏈，并在253nm 處提升了吸光度。酶的活性大小可以依據吸光度的前后變化來計算。肝胰腺中胃蛋白酶活性的測定原理是利用胃蛋白酶將底物蛋白質水解為含酚的氨基酸，然后根據含酚氨基酸可以還原酚試劑得到藍色物質，采用比色法測定胃蛋白酶活性的高低。
肝胰腺中Na+，K+-ATP 酶活性測定的原理是ATP 酶可以分解ATP 形成ADP 和無機磷，只需要測定產生的無機磷的含量就可以得出ATP 酶活性的高低。
肝胰腺中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活性測定采用賴氏法。
1.4 數據統計與分析
采用SPSS 25.0 軟件對試驗所得的數據進行細致的統計分析，第一步采用單因素方差分析方法（one-way ANOVA），然后進行 Turkey’s 檢驗法進行多重比較以分析所有數據的差異性。試驗數據統計時均以平均數±標準誤的形式表示，且數據都保留2 位小數。若組間比較之后，P 值等于或小于0.05，則認為有顯著性差異（P ≤ 0.05）。
2 結果
2.1 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中華絨螯蟹幼蟹生長的影響
根據表2 可知，在日投喂量基礎上額外投喂20%比例以下的發酵飼料后，各組增重率和特定生長率均隨著額外投喂比例的增加，呈現先升高后降低的趨勢，并且各處理組均較對照組顯著升高（P ＜0.05）。
幼蟹的存活率隨著發酵飼料額外投喂量增多，而呈逐漸下降的趨勢，但是各處理組較對照組差異不顯著（P ＞ 0.05）。
此外，各組間肝胰腺指數差異不顯著（P ＞ 0.05）。
2.2 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中華絨螯蟹幼蟹抗氧化能力的影響
根據表3 可知，隨著額外投喂發酵飼料量的增加，幼蟹血淋巴中脂質過氧化物含量升高，但各處理組都低于對照組，且各組間數值差異不顯著（P ＞ 0.05）。
血淋巴中過氧化氫酶含量隨著額外投喂發酵飼料量的增加呈現先升高后降低的趨勢，但都高于對照組，并且在額外投喂10%發酵飼料時達到最大值，其中F5、F10 和F15 組較對照組顯著升高（P＜ 0.05）。
各組間血淋巴中總抗氧化能力隨著額外投喂發酵飼料量的增加，呈現先升高后降低的趨勢，并且在F10 組達到最大，各處理組較對照組沒有顯著差異（P ＞ 0.05）。
2.3 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中華絨螯蟹幼蟹非特異性免疫能力的影響
由表4 可以看出，各處理組幼蟹血淋巴中酸性磷酸酶活性均高于對照組，但是差異不顯著（P ＞0.05）。
隨著發酵飼料額外投喂量的提高，各組幼蟹血淋巴中總蛋白、白蛋白和球蛋白含量均呈現先升高后降低的趨勢，但是各處理組較對照組差異不顯著（P ＞ 0.05）。
隨發酵飼料額外投喂量的增加，各組白球比先降低后升高，且各處理組較對照組無顯著差異（P＞0.05）。
2.4 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中華絨螯蟹幼蟹蛋白代謝酶活的影響
根據表5 可知，在日投喂量基礎上額外投喂20%比例以下的發酵飼料，幼蟹肝胰腺中胰蛋白酶和胃蛋白酶的活性隨著投喂量的增加，呈現逐漸下降的趨勢，但都高于對照組，其中F5 組、F10 組、F15 組肝胰腺中胰蛋白酶活性較對照組顯著升高（P ＜ 0.05），F5 組胃蛋白酶活性較對照組顯著升高（P ＜ 0.05），其他處理組較對照組無顯著差異（P ＞ 0.05）。
由表5 可知，隨著發酵飼料投喂量增多，肝胰腺中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性逐漸下降，但都高于對照組，其中F5 組谷草轉氨酶活性較對照組顯著升高（P ＜ 0.05），F5、F10 組谷丙轉氨酶活性較對照組顯著升高（P ＜ 0.05），其他處理組谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性則較對照組差異不顯著（P ＞ 0.05）。
3 討論
3.1 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中華絨螯蟹幼蟹生長的影響
發酵飼料是以微生物、復合酶為生物飼料發酵劑菌種，將飼料原料轉化為微生物菌體蛋白、生物活性小肽類氨基酸、微生物活性益生菌、復合酶制劑為一體生物發酵飼料。
本試驗結果表明，發酵飼料配伍配合飼料投喂，可以顯著提升中華絨螯蟹幼蟹的增重率和特定生長率，并且在額外投喂10%發酵飼料時，生長性能達到最好，表明發酵飼料配伍配合飼料投喂能夠促進中華絨螯蟹幼蟹的生長。
研究已經發現，飼料經過發酵后，經歷了一系列的生物化學反應，一部分大分子的纖維素和蛋白質被分解成小分子，易于動物的消化吸收，從而提高了飼料中有機質和蛋白質的消化率。此外，飼料經過大量的益生菌發酵后，擁有了特殊的酸香味和良好的適口性，可刺激動物的食欲，增加其采食量。因此，發酵飼料配伍配合飼料投喂，對中華絨螯蟹幼蟹的促生長作用主要是因為發酵飼料有更好的消化利用率、誘食作用和良好的適口性。
3.2 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中華絨螯蟹幼蟹抗氧化能力的影響
在動物體內，抗氧化防御體系主要通過抗氧化酶和還原性物質來消除細胞代謝過程中產生的氧自由基，避免其對動物機體造成氧化損傷，是水生動物應對應激和脅迫的重要生理機制，關系到水生動物的健康狀態。
脂質過氧化物是機體中的活性氧與生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸反應的產物，在氧化應激時，其含量會大幅升高，它們能與細胞中的大分子物質如蛋白質和DNA 作用，進而引起細胞的氧化損傷，其含量的高低反映了動物體內脂質過氧化的水平。本試驗中隨著發酵飼料額外投喂量的增加，幼蟹血淋巴中的脂質過氧化物含量先降低后升高，并且都低于對照組，說明發酵飼料的投喂減少了中華絨螯蟹體內的膜脂質過氧化產物，降低了過氧化水平。
過氧化氫酶廣泛存在于動物體各組織中，其主要功能是催化細胞內的過氧化氫分解，防止其氧化造成細胞損傷。徐奕晴等人的試驗發現提高飼料中生物發酵飼料的含量，中華絨螯蟹幼蟹的肝胰腺中過氧化氫酶含量先上升后下降。本試驗中，幼蟹血淋巴中過氧化氫酶活性隨發酵飼料額外投喂量的增多，呈現先上升后下降的趨勢，并均高于對照組，表明發酵飼料的投喂可以有效促進中華絨螯蟹幼蟹抗氧化能力的提高，并且在額外投喂10%時取得最好的促進效果。
總抗氧化能力常被用作衡量動物體內抗氧化系統能力的綜合指標，它的高低可以反映機體對抗外來刺激的能力和代謝體內自由基的狀態。正常的情況下，動物在新陳代謝的過程中，氧自由基不斷生成，又不斷被消除，處在動態平衡中。本試驗中測得各組幼蟹血清中的總抗氧化能力無顯著差異，表明蟹體內氧自由基的生成和及時清除均處于合理的動態平衡中。
3.3 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中華絨螯蟹幼蟹非特異性免疫能力的影響
研究已經證明，蝦、蟹等甲殼動物不具有特異性免疫，它們主要依靠血淋巴中的免疫相關酶、免疫因子和酚氧化酶原激活系統等來進行免疫，稱為非特異性免疫。血淋巴中酸性磷酸酶是溶酶體的重要組成部分，具有吞噬細胞殺菌的作用，能夠消除外來物，進行機體的防御。陳昌福等人采用免疫多糖對南美白對蝦進行腹腔注射后，發現其肝胰腺中的酸性磷酸酶活性提高，表明了體內免疫系統的激活。因此酸性磷酸酶活性可被用來評判甲殼動物的免疫能力。本試驗中觀察到隨著發酵飼料額外投喂量的增加，酸性磷酸酶活性呈現先升高后降低，但都高于對照組的現象，可以認為發酵飼料可以提升幼蟹免疫能力，并且在10%額外投喂時達到最好效果。
血淋巴中總蛋白的含量除了能夠反映動物體內蛋白代謝和營養吸收的水平，它同時也與機體的免疫有密切的關聯。血淋巴中的球蛋白主要參與動物機體的體液免疫，因此其含量的升高可以反映機體的免疫力提高。研究表明，飼料經益生菌發酵后投喂仔豬，其血清中的總蛋白以及球蛋白含量均提高。在本試驗中，發酵飼料配合基礎飼料投喂后幼蟹血淋巴中總蛋白和球蛋白含量均較對照組升高，說明發酵飼料對幼蟹的健康生長有正向促進作用，并且可以提高幼蟹的免疫能力。
3.4 發酵飼料配伍配合飼料投喂對中華絨螯蟹幼蟹蛋白代謝酶活的影響
蛋白酶的主要作用是催化蛋白質的水解，而谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶是肝臟中最重要的氨基轉移酶，與機體的氨基酸代謝密切相關。大量研究已經證明，肝胰腺中蛋白酶活性和轉氨酶活性的升高，說明了動物體內蛋白質的吸收和氨基酸的代謝更為旺盛，表明動物體對飼料中的蛋白質利用率升高。
Abasubong 等在飼料中添加低聚木糖后，觀察到團頭魴肝臟中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性升高，日增長指數升高。Ketnawa 等模擬了豬體外消化發酵豆粕的試驗，發現豆粕經過發酵后改善了蛋白質的消化率。一方面在多菌種混合發酵飼料的過程中，菌種會產生大量蛋白酶，隨飼料進入動物體后促進動物的消化吸收；另一方面飼料經過發酵后，其中的大分子蛋白質被分解為小分子的肽類，而抗營養因子如胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素、植酸等則大部分被去除，有利于動物對蛋白的吸收。
本試驗中，隨著發酵飼料額外投喂量的增加，幼蟹肝胰腺中胰蛋白酶、胃蛋白酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性均呈現先升高后降低的趨勢，并且都高于對照組，表明了發酵飼料的額外投喂可以有效促進幼蟹的蛋白質和氨基酸的代謝，最終促進了中華絨螯蟹幼蟹的生長發育。
本試驗的結果表明，在配合飼料投喂的基礎上，額外投喂日投喂量20%以下的發酵飼料，中華絨螯蟹幼蟹生長性能顯著升高，抗氧化和免疫能力加強，蛋白酶和轉氨酶活性提升，并且對生長、抗氧化和免疫能力的促進作用均在10% 額外投喂量時達到最理想效果。說明發酵飼料的額外投喂對中華絨螯蟹的生長、抗氧化、免疫和蛋白代謝各方面均有益處，并且最適宜額外投喂量為10%。
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