枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及其復(fù)合菌發(fā)酵棉粕營養(yǎng)成分變化的研究
枯草芽孢桿菌-1為石河子大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室篩選；釀酒酵母(CICC 1001)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)；棉粕、麩皮、糖蜜均由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司提供。
LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，氯化鈉10g/L；YPD培養(yǎng)基：酵母浸出粉10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L。
稱取棉粕84.1g、麩皮9.4g混勻，稱取糖蜜6.5g溶于66mL蒸餾水中，加入底物中，充分混勻后稱取30g于500mL三角瓶中，6層紗布封口，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫。試驗(yàn)I組接種3％(3mL)的枯草芽孢桿菌種子液(活菌數(shù)約為1．925×108CFU/mL)；試驗(yàn)Ⅱ組接種釀酒酵母種子液(活菌數(shù)約為2.05×107CFU/mL）；試驗(yàn)Ⅲ組按3％的比例分別接種枯草芽孢桿菌-l和釀酒酵母種子液于發(fā)酵底物中(枯草芽孢桿菌：酵母菌=1：1)。混勻后于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)I、Ⅱ、Ⅲ組培養(yǎng)溫度分別為37、30、30℃，每12h振蕩一次，發(fā)酵72h，發(fā)酵結(jié)束后將樣品于45℃烘箱中干燥24h。每組9個(gè)重復(fù)。
感官評(píng)定：發(fā)酵72h后，每組隨機(jī)抽取3個(gè)發(fā)酵飼料瓶的飼料進(jìn)行感官評(píng)定。
常規(guī)營養(yǎng)成分指標(biāo)：測(cè)定發(fā)酵前后樣品CP、干物質(zhì)(DM)、粗灰分(Ash)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗脂肪(EE)、鈣(Ca)、磷(P)含量。
酸溶蛋白質(zhì)含量：準(zhǔn)確稱取樣品5.0g(精確至0.001g)，溶于15％三氯乙酸(TCA)溶液并稀釋定容至50mL，混勻。將混合物靜置5min，過濾，去除初濾液，濾液用作儲(chǔ)備液。移取10～25mL濾液，按照粗蛋白質(zhì)測(cè)定的步驟進(jìn)行。
游離氨基酸含量：采用日立L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，儀器條件：色譜柱SHISEIDO C18，4.6mm×250mm×5mm，進(jìn)樣量l0μL，柱溫40℃，波長254 nm，流動(dòng)相：A，0.1mol/L無水乙酸鈉：乙腈=97：3(V/V)，混勻后調(diào)pH至6.5；B，乙腈：水=80：20(V/V)(表1)。樣品前處理：取適量樣品于離心管中，加入0.02 mol/L HCl 10 mL，渦旋1min，超聲10min，避光靜置2h。將上述溶液離心，分取1mL，加入1mL 7％磺基水楊酸，渦旋1min，避光靜置1h。分取500μL，加入250 μL 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈，250μL 1mol/L三乙胺乙腈，衍生1h。加入2mL正己烷，震蕩，靜置。分層后取下層過膜上機(jī)。
樣品棉籽肽含量參考大豆肽粉(GB/T 22492—2008)的測(cè)定方法，樣品酸溶蛋白質(zhì)含量減去其中游離氨基酸的含量即為棉籽肽含量。
采用SPSS 25.0軟件One-Way ANOVA方法進(jìn)行方差分析，同時(shí)采用LSD法進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。
由表3可知，棉粕經(jīng)枯草芽孢桿菌-1、釀酒酵母和復(fù)合菌發(fā)酵后，常規(guī)營養(yǎng)成分均有不同程度的變化；I組的DM、CP和Ash含量極顯著高于其他各組(P<0.01)；對(duì)照組的EE含量極顯著高于其他各組(P<0.01)；Ⅲ組的ADF極顯著低于其他各組(P<0.01)，各組之間NDF含量差異不顯著(P>0.05)，與對(duì)照組相比，發(fā)酵棉粕組NDF含量分別降低了11.80％、5.23％、1.36％；各發(fā)酵棉粕組的Ca和P含量均有所提高，其中，Ⅲ組Ca和P含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而與I和Ⅱ組差異不顯著(P>0.05)。
由表4可知，枯草芽孢桿菌-1發(fā)酵棉粕可降低棉籽粕中絲氨酸含量，同時(shí)提高天冬氨酸、胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸含量。釀酒酵母和復(fù)合菌發(fā)酵棉籽粕均可降低棉粕中胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸和蛋氨酸含量，同時(shí)提高天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、組氨酸含量。復(fù)合菌發(fā)酵棉粕中脯氨酸和丙苯氨酸含量較高。
由表5可知，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組發(fā)酵棉粕酸溶蛋白質(zhì)含量、棉籽肽含量均極顯著提高(P
由表6可知，對(duì)照組的蛋白分子質(zhì)量較大，分子質(zhì)量>1000u的占23.4l％，l000u以下的占76.59％。而通過枯草芽孢桿菌-1、釀酒酵母和復(fù)合菌發(fā)酵之后，棉粕中大分子蛋白明顯被降解為小分子蛋白、游離氨基酸和棉籽肽。與對(duì)照組相比，各發(fā)酵試驗(yàn)組1000u以下的棉籽肽峰面積百分比分均有提高，分別為89.41％、77.61％和84.58％。
在發(fā)酵初期，物料黏度小，通過晃動(dòng)和淺層供應(yīng)氧氣，好氧菌得以快速生長并產(chǎn)酶，在發(fā)酵后期，物料黏度增大，晃動(dòng)難度加大，發(fā)酵物料間氧氣耗盡，進(jìn)行無氧發(fā)酵。枯草芽孢桿菌-1在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生CO2，在發(fā)酵后期進(jìn)行無氧發(fā)酵，最終產(chǎn)物黏度大，成塊嚴(yán)重，且有濃郁的枯草腐敗味。釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生CO2、酒精和水，發(fā)酵產(chǎn)物氣味香甜。因此采用復(fù)合菌發(fā)酵可改變單一使用枯草芽孢桿菌-1發(fā)酵的氣味，從而提高棉粕的應(yīng)用效果。
在常規(guī)營養(yǎng)成分中，CP、EE和粗纖維是評(píng)定棉粕質(zhì)量的幾個(gè)重要指標(biāo)。金紅春等、鮑振國及孫煥林等通過研究復(fù)合芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后CP含量均顯著提高。本試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌發(fā)酵極顯著提高了棉粕的CP含量，一方面可能是由于微生物在發(fā)酵過程中會(huì)向胞外分泌多肽和酶蛋白等物質(zhì)，且大量生長繁殖使菌體蛋白增多，因而提高了CP的含量，另一方面可能是由于發(fā)酵消耗了碳水化合物等物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物的總質(zhì)量減少，從而CP含量顯著提高。研究發(fā)現(xiàn)，利用由乳酸菌與酵母菌等主要有益菌組成的復(fù)合菌發(fā)酵棉籽殼，可使NDF和ADF含量降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵棉粕中ADF、NDF、EE的含量降低，這主要是由于微生物在生長繁殖的過程中能夠分泌纖維素酶和脂肪酶，并且利用這些纖維素酶分解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，將其轉(zhuǎn)化為寡糖，使粗纖維含量降低，同時(shí)脂肪酶分解EE，使EE含量也降低；發(fā)酵后棉粕DM和Ash含量提高，可能與發(fā)酵底物中加人7％糖蜜有關(guān)，也可能與糖和脂類等有機(jī)物在發(fā)酵過程中消耗而引起礦物質(zhì)累積有關(guān)：微生物在生長代謝過程中消耗能量，使能量物質(zhì)減少，Ca和P在干物質(zhì)中的比例就相對(duì)提高。
發(fā)酵飼料中氨基酸含量的高低是蛋白質(zhì)飼料品質(zhì)好壞的一個(gè)重要指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組總游離氨基酸均比對(duì)照組有大幅提高，說明微生物發(fā)酵可以將棉粕中大分子蛋白降解為小分子蛋白及游離氨基酸，從而提高棉粕中總游離氨基酸的含量。研究發(fā)現(xiàn)，以復(fù)合芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵棉粕，發(fā)酵后總游離氨基酸提高了9.98％。王曉玲等利用枯草芽孢桿菌ST-141與釀酒酵母N5對(duì)棉粕進(jìn)行混合菌固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基酸總量上升22.2％，必需氨基酸含量增加28.4％。劉俊等以混合菌發(fā)酵棉粕發(fā)現(xiàn)，各游離必需氨基酸含量均有較大提高，總游離必需氨基酸由0.65％提高到了24.00％。吳偉偉等利用黑曲霉和釀酒酵母混合固態(tài)發(fā)酵棉籽餅粕，結(jié)果表明，17種游離氨基酸總量較發(fā)酵前增加了30.10％，必需氨基酸中賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸分別較發(fā)酵前提高了31.03％、25.00％和44.23％。綜上所述，微生物發(fā)酵可以使棉粕中總游離氨基酸含量更加豐富，有效改良棉粕的品質(zhì)，提高其營養(yǎng)價(jià)值。
食品國家標(biāo)準(zhǔn)《大豆肽粉GBT 22492》2008版將小肽的標(biāo)準(zhǔn)由<10ku降低到<5ku。其檢測(cè)原理：高分子蛋白質(zhì)在酸性條件下易被沉淀，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)水解物(酸溶蛋白質(zhì))可溶于酸性溶解液(其中包含肽及游離氨基酸)。樣品經(jīng)酸化后，濾液中的酸溶蛋白質(zhì)含量減去游離氨基酸含量即為肽含量。常磊及亓秀曄等研究了枯草芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌復(fù)合菌發(fā)酵棉粕的效果，結(jié)果表明，酸溶蛋白質(zhì)含量分別達(dá)到了22.49％和23.54％。卜小麗等以枯草芽孢桿菌與酵母菌(2：1)混合菌發(fā)酵棉粕，小肽含量為11.13％，較發(fā)酵前提高了20.19％。李全豐對(duì)比了植物乳桿菌、產(chǎn)阮假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉4株菌在生料固態(tài)發(fā)酵棉籽蛋白粉制備小肽中的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌可以使發(fā)酵棉籽蛋白粉中小肽含量從0.41％增加到5.36％。劉俊等通過單菌及組合菌發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，最適菌種組合為B．Subtilis(H1)和A．niger(P1)。兩菌株復(fù)合發(fā)酵后，小分子多肽含量提高了11％。吳勝華等利用兩種芽孢桿菌加上乳酸菌和酵母菌，采用固態(tài)發(fā)酵制備小肽，小肽總含量由1.6l％提高到12.01％(DM基礎(chǔ))。劉建成研究表明，在優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件下，棉粕寡肽的生產(chǎn)量可達(dá)32.13％。本試驗(yàn)最終結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌-1發(fā)酵、釀酒酵母發(fā)酵和復(fù)合菌發(fā)酵后棉籽肽含量分別由發(fā)酵前韻3.21％提高到發(fā)酵后的27.19％、15.84％和20.34％，說明枯草芽孢桿菌-1降解棉粕大分子蛋白為棉籽肽效果最好。以上研究結(jié)果表明，微生物發(fā)酵棉粕可以更好地將大分子蛋白質(zhì)降解為小分子棉籽肽。
在現(xiàn)有的小肽分子質(zhì)量分布檢測(cè)方法中，最準(zhǔn)確的可以測(cè)定出小肽含量和小肽分布情況的是利用高效液相色譜測(cè)定。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，棉粕原料的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大，分子質(zhì)量在1000u以上的占23.41％，1000u以下的占76.59％。而通過枯草芽孢桿菌-1、釀酒酵母發(fā)酵和復(fù)合菌發(fā)酵之后，1000u以上和1000u以下的峰面積百分比分別為10.6％、22.39％、15.42％和89.41％、77.61％、84.58％，據(jù)此推測(cè)，微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類可將棉粕中大分子蛋白質(zhì)降解為小分子棉籽肽和游離氨基酸。劉俊篩選得到了改良棉粕蛋白質(zhì)價(jià)值效果較好的4株菌混合物，利用其發(fā)酵后，平均分子質(zhì)量在66ku附近的棉粕蛋白質(zhì)被降解至14ku 以下。孫煥林等對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕的營養(yǎng)特性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：分子質(zhì)量為
在本試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌-1發(fā)酵棉粕CP、DM、總游離氨基酸、酸溶蛋白質(zhì)及棉籽肽的含量顯著提高，同時(shí)可有效將棉粕中大分子蛋白降解為小分子多肽和游離氨基酸，然而其發(fā)酵產(chǎn)物硬度大，難以粉碎，有很濃郁的枯草腐敗味。枯草芽孢桿菌-1和釀酒酵母復(fù)合菌發(fā)酵顯著提高了棉粕中Ca、P、DM、Ash、總游離氨基酸、酸溶蛋白質(zhì)及棉籽肽含量，降低了EE和ADF含量，發(fā)酵產(chǎn)物有濃郁的酒香味，在一定程度上提高了其適口性。從發(fā)酵棉粕的適口性來說，復(fù)合菌發(fā)酵優(yōu)于枯草芽孢桿菌-1和釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵，從發(fā)酵棉粕營養(yǎng)價(jià)值來說，枯草芽孢桿菌-1發(fā)酵優(yōu)于復(fù)合菌和釀酒酵母發(fā)酵。
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