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酵母培養物對山羊亞急性瘤胃酸中毒體外發酵模型的調控作用

2020-10-14 17:10:20      點擊:

摘 要:本試驗旨在探究酵母培養物(YC)對山羊亞急性瘤胃酸中毒外發酵模型的調控作用。采用體外批次培養法,在不同非纖維性碳水化合物(NFC)/中性洗滌纖維(NDF)[1.19(常規底物)和2.30(高NFC底物)]的底物中分別添加6個水平[0(對照)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%]的YC,探究其對瘤胃發酵參數的影響,并用多項指標綜合指數(MFAEI)進行評定,篩選出在不同NFC/NDF條件下最適YC添加水平。結果表明:1)在高NFC底物條件下,發酵液pH低于5.8時長超過3h,體外亞急性瘤胃酸中毒模型建立成功;且添加YC能夠穩定9~12h的pH,顯著降低12和24h乳酸含量(P<0.05),顯著降低9和12h氨態氮(NH3-N)含量(P<0.05),顯著提高12h微生物蛋白(MCP)含量(P<0.05),顯著提高3、6、12、24h乙酸百分比(P<0.05),顯著提高24h總揮發性脂肪酸(TVFA)含量(P<0.05)。2)在常規底物條件下,YC能穩定瘤胃發酵液24h的pH,顯著降低12h乳酸含量(P<0.05),顯著提高9h的NH3-N含量、6和12hMCP含量及3~24hTVFA含量(P<0.05)。3)MFAEI結果表明,常規底物條件下,以1.5%的YC添加水平對體外發酵作用效果最佳;高NFC底物條件下,以2.0%的YC添加水平對亞急性瘤胃酸中毒的緩解作用最佳。因此,在高NFC底物條件下添加YC的作用效果更好,能通過降低發酵液中乳酸含量達到調控瘤胃發酵液pH的效果,具有緩解亞急性瘤胃酸中毒的潛力。

我國優質粗飼料資源缺乏,為滿足生產需要許多養殖者通過在反芻動物飼糧中添加高精料以滿足動物的營養需要,但高精料的過度攝入會導致動物發生亞急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis,SARA)。SARA的產生不僅給我國反芻動物養殖業帶來了很巨大的損失,而且也是阻礙我國反芻動物發展的主要阻力之一。近年來,許多學者都致力于尋找一種能高效、無副作用緩解瘤胃酸中毒的方法,現有的緩解瘤胃酸中毒癥狀的方法有:添加緩沖劑、接種乳酸利用菌、添加有機酸、添加硫胺素、接種疫苗。這些方法雖在一定程度上能夠緩解瘤胃酸中毒所帶來的經濟損失,但是也均存在一定的弊端,不能從根本上解決瘤胃酸中毒這個問題。酵母培養物(yeast culture,YC)作為一種微生物發酵產物添加劑,有望通過調節瘤胃微生物區系的穩定來達到調控瘤胃酸中毒的效果。

YC是由酵母菌在特定培養基上經過特定的制作工藝發酵而成的一種微生物添加劑,其中富含維生素B、微量元素、未知營養因子、霉菌吸附劑寡糖、消化酶、氨基酸、有機酸和碳水化合物。近年來,YC作為一種微生物添加劑已經在反芻動物生產中廣泛應用,能夠改善瘤胃發酵模式和提高動物生產性能。有研究表明,YC可以通過減少乳酸的產生、增加瘤胃微生物對乳酸的利用量而穩定瘤胃pH。但也有研究表明,YC對瘤胃pH沒有顯著影響,但能夠降低瘤胃內的乳酸含量。YC對反芻動物作用的效果受菌株種類、飼糧類型、活菌含量等多種因素影響,體內、外試驗結果也不盡相同。因此,本試驗以薩能山羊為試驗動物,通過體外批次培養法,探討在不同非纖維性碳水化合物(NFC)/中性洗滌纖維(NDF)底物條件下添加不同水平的YC對由高NFC飼糧誘發的SARA的調控作用,為YC在山羊生產中的應用提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗動物及飼糧

選取3只體重相近、安裝有永久性瘤胃瘺管的健康薩能山羊作為體外發酵瘤胃液的供體,飼糧組成及營養水平如表1所示。試驗所用YC是由湖北某酵母股份有限公司提供,經釀酒酵母菌屬發酵而成的,其成分為:酵母活細胞數≥2億個/g,粗蛋白質含量≥20%,甘露寡糖含量≥10%,水分含量≤8%。試驗動物每日飼喂2次(07:00和19:00),單欄飼養,自由飲水,試驗在揚州大學動物科技學院動物房進行。

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1.2 試驗設計

試驗為單因素試驗設計,在不同NFC/NDF[1.19(常規底物)和2.30(高NFC底物)]的底物中分別添加6個水平[0(對照)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%]的YC,采用體外批次培養法探究其對瘤胃發酵參數的影響。

1.3 瘤胃液的采集

試驗當天于晨飼前進行瘤胃液的采集,采用自制真空負壓裝置采集山羊瘤胃前、中、后3個不同部位的瘤胃液,之后迅速混勻經4層紗布過濾,裝入提前預熱且充滿二氧化碳(CO2)的保溫瓶中迅速帶回實驗室,于38℃恒溫水浴鍋中保溫,并持續通以CO2。

1.4 體外發酵液與底物的配制

試驗選用半純合飼糧為發酵底物,底物組成如表2所示;試驗所用人工唾液,參照Leedle等的方法配制而成,將配制好的人工唾液放入水浴鍋中水浴至38℃并持續通入CO2備用。將60mL瘤胃液和人工唾液的混合液(瘤胃液∶人工唾液=1∶2)分裝至厭氧培養瓶中,分裝時向發酵瓶中通5s以上CO2以排除空氣,分裝完畢迅速加蓋異丁基塑膠塞,并以黑色塑料旋擰蓋固定密封,置于38℃恒溫水浴搖床中進行培養。每個時間點每組設置3個重復,分別于培養后的3、6、9、12、24h采集發酵液,用于測定各發酵參數。

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1.5 發酵參數測定方法

發酵液pH選用pHS-3C型pH計進行測定;氨態氮(NH3-N)含量參考Broderick等的苯酚-次氯酸鈉比色法進行測定;揮發性脂肪酸(VFAs)含量參照Kawamoto等和Khan等的氣相色譜法,用日本津島公司生產的GC-9A氣相色譜儀進行測定;微生物蛋白(MCP)含量參照嘌呤法,用紫外分光光度計進行測定;乳酸含量使用南京建成生物工程研究所A019-2乳酸試劑盒測定。

1.6 數據處理

用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析,并用Duncan氏法進行多重比較,并應用多項指標綜合指數(MFAEI)進行評定,P≤0.05表示差異顯著。

式中:A1是對照組各個時間點各指標數值;A2分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%及2.5%組各個時間點各指標數值;A3是在每個時間點A2總和的平均值。MFAEI為各SFAEI的加和值。

2結果

2.1 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC對瘤胃發酵液pH的影響

由表3可知,在不同底物發酵條件下發酵液pH隨著發酵時間的延長而降低。常規底物條件下,發酵3~12h時,各試驗組發酵液pH均高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);發酵24h時,0.5%組、1.0%組和1.5%組發酵液pH均顯著高于對照組(P<0.05),2.0%組與2.5%組發酵液pH與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

高NFC底物條件下,發酵3和6h時,各試驗組發酵液pH均高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);發酵9h時,2.0%組與2.5%組發酵液pH顯著高于對照組(P<0.05),其余各組發酵液pH雖有所升高,但差異不顯著(P>0.05);發酵12h時,2.0%組與2.5%組發酵液pH顯著高于對照組(P<0.05),1.0%組與1.5%組發酵液pH顯著低于對照組(P<0.05),0.5%組發酵液pH與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。發酵24h時,0.5%組、1.0%組和1.5%組瘤胃發酵液pH顯著高于對照組(P<0.05),2.0%組和2.5%組與對照組無顯著差異(P>0.05)。

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2.2 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC對瘤胃發酵液NH3-N含量的影響

由表3可知,在不同底物條件下隨著發酵時間的延長,發酵液NH3-N含量均呈現升高的趨勢。常規底物條件下,各組NH3-N含量在發酵12h時達到最高,在24h時有所降低。發酵3、6和12h時,各試驗組NH3-N含量均高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);發酵9h時,1.0%組和1.5%組NH3-N含量顯著高于對照組(P<0.05),其他各試驗組NH3-N含量雖高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);發酵24h時,1.5%組NH3-N含量顯著低于其他各組(P<0.05),其他各組間無顯著差異(P>0.05)。

高NFC底物條件下,發酵3h時,添加YC各組NH3-N含量均高于對照組,其中1.5%組、2.0%組和2.5%組與對照組相比差異顯著(P<0.05),0.5%組和1.0%組與對照組相比無顯著差異(P>0.05);發酵6h時,1.0%組的NH3-N含量最低,且顯著低于對照組(P<0.05),其余試驗組與對照組相比均無顯著差異(P>0.05);發酵9h時,添加YC各組NH3-N含量均低于對照組,且差異顯著(P<0.05),1.5%組NH3-N含量顯著低于對照組(P<0.05);發酵12h時,1.5%組NH3-N含量顯著低于對照組(P<0.05),其余各試驗組與對照組相比無顯著差異(P>0.05);發酵24h時,0.5%組和1.5%組NH3-N含量顯著低于對照組(P<0.05),其他各組間無顯著差異(P>0.05)。

2.3 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC對瘤胃發酵液MCP含量的影響

由表3可知,在不同底物條件下MCP含量隨著發酵時間的延長呈現先升高再降低的趨勢。常規底物條件下,發酵3、9和24h時,各試驗組MCP含量均高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);發酵6h時,1.5%組MCP含量顯著高于對照組(P<0.05),其他各試驗組MCP含量與對照組相比差異不顯著(P>0.05);發酵12h時,添加YC各組MCP含量均高于對照組,其中1.5%組和2.0%組差異顯著(P<0.05),其他各試驗組與對照組之間無顯著差異(P>0.05)。

高NFC底物條件下,發酵3h時,0.5%組、1.0%組和1.5%組MCP含量顯著低于對照組(P<0.05),2.0%組和2.5%組與對照組相比無顯著差異(P>0.05);發酵6h時,1.5%組和2.0%組MCP含量顯著高于對照組(P<0.05),其余各試驗組與對照組相比無顯著差異(P>0.05);發酵9h時,1.5%組MCP含量顯著高于對照組(P<0.05),1.0%組和2.5%組MCP含量顯著低于對照組(P<0.05),0.5%組與2.0%組與對照組相比無顯著差異(P>0.05);發酵12h時,添加YC的各組MCP含量顯著高于對照組(P<0.05),其中以1.5%組最高;發酵24h時,各組間MCP含量無顯著差異(P>0.05)。

2.4 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC對瘤胃發酵液乳酸含量的影響

由表3可知,在不同底物條件下各組乳酸含量均隨著發酵時間的延長而逐漸升高。常規底物條件下,發酵3~9h時,各試驗組乳酸含量均低于對照組,但差異不顯著(P>0.05);發酵12h時,添加YC各組乳酸含量均顯著低于對照組(P<0.05);發酵24h時,1.5%組和2.5%組乳酸含量與對照組相比差異不顯著(P>0.05),1.0%組和2.0%組乳酸含量顯著高于對照組(P<0.05),0.5%組乳酸含量顯著低于對照組(P<0.05)。

高NFC底物條件下,發酵3~9h時,各試驗組乳酸含量與對照組相比無顯著差異(P>0.05);發酵12和24h時,添加YC各組乳酸含量均顯著低于對照組(P<0.05),其中發酵12h時以0.5%組乳酸含量最低,發酵24h時,以0.5%組和1.5%組乳酸含量最低。

2.5 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC對瘤胃發酵液VFAs含量的影響

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由表4可知,發酵液總揮發性脂肪酸(TVFA)含量隨著發酵時間的延長持續升高且發酵各階段TVFA含量均高于對照組。常規底物條件下,發酵3h時,1.5%組和2.5%組丙酸百分比顯著高于對照組(P<0.05),2.5%組丁酸百分比顯著高于對照組(P<0.05),0.5%組、1.0%組、2.0%組TVFA含量均顯著高于對照組(P<0.05),1.5%組和2.5%組與對照組相比無顯著差異(P>0.05);發酵6h時,0.5%組和1.5%組丁酸百分比顯著高于對照組(P<0.05),2.0%組TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05),其他各試驗組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。發酵9h時,2.0%組丙酸百分比顯著高于對照組(P<0.05),2.5%組顯著低于對照組(P<0.05),0.5%組、1.5%組、2.0%組和2.5%組丁酸百分比顯著高于對照組(P<0.05),0.5%組和1.5%組TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05),但1.0%組、2.0%組和2.5%組雖有升高的趨勢但差異不顯著(P>0.05)。發酵12h時,2.0%組和2.5%組丙酸百分比顯著高于對照組(P<0.05),0.5%組、1.0%組、1.5%組和2.0%組丁酸百分比顯著高與對照組(P>0.05),1.0%組TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05),2.5%組與對照組相比無顯著差異(P>0.05),0.5%組、1.5%組和2.0%組TVFA含量顯著低于對照組(P<0.05)。發酵24h時,1.5%組和2.0%組丙酸百分比顯著低于對照組(P<0.05);2.0%組的丁酸百分比顯著高于其他各組(P<0.05);2.0%組和2.5%組TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05)。發酵3~24h,各組間乙酸百分比均無顯著差異(P>0.05)。

高NFC底物條件下,發酵3h時,2.0%組和2.5%組乙酸百分比顯著高于對照組(P<0.05);0.5%組、1.5%組、2.0%組和2.5%組丙酸百分比顯著低于對照組(P<0.05);2.0%組和2.5%組丁酸百分比顯著高于對照組(P<0.05);1.5%組TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05),2.0%組和2.5%組TVFA含量顯著低于對照組(P<0.05)。發酵6h時,2.0%組和2.5%組乙酸百分比顯著高于對照組(P<0.05)。發酵9h時,2.0%組和2.5%組丁酸百分比顯著高于對照組(P<0.05);1.0%組和1.5%組TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05)。發酵12h時,2.0%組和2.5%組乙酸百分比顯著高于對照組(P<0.05);2.5%組丙酸百分比顯著低于對照組(P<0.05);2.0%組丁酸百分比顯著高于對照組(P<0.05);0.5%組、1.5%組和2.0%組TVFA含量顯著低于對照組(P<0.05),2.5%組與對照組相比無顯著差異(P>0.05),1.0%組TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05)。發酵24h時,各組間乙酸百分比無顯著差異(P>0.05),2.0%組丙酸百分比顯著高于對照組(P<0.05);0.5%組和1.0%組TVFA含量顯著低于對照組(P<0.05),2.0%組和2.5%組顯著高于對照組(P<0.05),1.5%組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.6 不同YC添加水平對瘤胃發酵液參數的綜合評定

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由表5知,不同底物條件下添加YC對個單項發酵指標的影響不同。常規底物條件下,pH以2.0%組和2.5%組較高;NH3-N含量以1.0%組和2.0%組較高;MCP含量以1.5%組和2.5%組較高;TVFA含量以1.5%組和2.5%組較高。高NFC底物條件下,pH以2.0%組和2.5%組較高;NH3-N含量以2.0%組和2.5%組較高;MCP含量以1.5%組和2.0%組較高;TVFA含量以2.0%組和2.5%組較高。從體外發酵單項指標無法確定YC適宜的添加水平,因此,需對各項指標進行綜合評定。在進行不同YC添加水平瘤胃發酵指標的組合效應綜合評定時,選定不添加YC組作為參照,依據MFAEI對pH及NH3-N、MCP和TVFA含量進行綜合評定。常規底物條件下,MFAEI自高到底的排序為1.5%組>2.5%組>2.0%組>1.0%組>0.5%組,因此,常規底物條件下,以1.5%的YC添加水平對體外發酵作用效果最佳。高NFC底物條件下,MFAEI自高到底的排序為2.0%組>2.5%組>0.5%組>1.0%組>1.5%組,因此,高NFC底物條件下以2.0%的YC添加水平對體外發酵作用效果最佳。

3討論

反芻動物短時間采食過量易發酵碳水化合物,其在瘤胃微生物作用下轉化為大量有機酸(VFA和乳酸),導致瘤胃pH下降,進而引起SARA。有研究將瘤胃液pH5.8作為SARA的診斷依據。瘤胃液pH的變化主要是受瘤胃液中TVFA和乳酸含量的影響,由于乳酸電離度遠高于一般的VFA,因此乳酸對瘤胃pH的影響更大。本試驗結果表明,常規底物發酵過程中,發酵前12h發酵液pH均高于5.8,發酵24h時,對照組發酵液pH低于5.8,且添加YC能夠顯著提高瘤胃發酵液24h的pH,這與Lila等的研究結果不一致,可能是由于所選用YC的種類不同,且體外條件下發酵過程中所積累的VFA和乳酸不能及時的被瘤胃壁代謝吸收而導致24h的發酵液pH的降低。高NFC底物發酵過程中,對照組發酵9~24h時,發酵液pH低于5.8超過3h,這說明體外SARA模型建立成功。添加YC能夠顯著提高9~24h瘤胃發酵液pH,減少發酵液pH低于5.8的時間可以維持瘤胃pH的穩定,這與劉相玉等試驗結果一致。底物中添加YC能顯著提高TVFA含量,但同一時間點添加不同水平的YC對TVFA含量的影響并不一致,這可能是由于所添加活菌數不同而導致的,Dawson等研究表明,活菌含量的多少會影響YC的作用效果。乳酸作為瘤胃代謝的重要中間產物,其對瘤胃液pH的影響很大,有研究表明,瘤胃中乳酸的不斷積累會導致乳酸產生菌和乳酸利用菌失衡,進而導致SARA的發生。乳酸含量的高低在一定程度上反映YC對SARA的調控作用效果是否顯著,本試驗結果表明,在高NFC底物條件下,添加YC能夠顯著降低9~24h時發酵液中乳酸含量,這與劉相玉等研究結果一致,這可能是由于YC中營養物質能夠促進瘤胃中乳酸利用菌的利用,進而降低發酵液中乳酸含量。在高NFC底物條件下,添加YC能夠顯著提高TVFA含量,降低乳酸含量,穩定瘤胃液pH,具有緩解SARA的效果。

反芻動物主要以VFA的形勢利用碳水化合物,其中乙酸、丙酸和丁酸占瘤胃內TVFA總量的95%左右。乙酸是乳脂合成的主要前體,丙酸則是通過糖異生作用合成機體所需的葡萄糖,因此丙酸發酵型可為機體提供更多的能量,有利于提高動物的生產性能和飼料利用率。本試驗中,常規底物條件下,添加YC對乙酸及丙酸比例無顯著影響,但顯著提高了丁酸比例和TVFA含量;而高NFC底物條件下,添加YC能夠降低乙酸比例,提高丙酸和丁酸比例,提高TVFA含量。這可能是因為在不同NFC/NDF底物中,YC對其的作用效果不同,這與丁耿芝研究結果一致,隨著飼糧粗精比的升高,丙酸比例提高而乙酸比例降低。這也說明在高NFC底物條件下,添加YC能夠促進瘤胃發酵類型向丙酸發酵型發展。

NH3-N含量在一定程度上反映了瘤胃微生物對底物含氮物質的利用程度,MCP主要是反映瘤胃微生物對發酵液中氮源的利用情況,其為動物機體提供蛋白質需要量的70%~80%。在體外試驗中YC對NH3-N含量的影響作用存在爭議,但有研究表明,添加YC能提高瘤胃液中MCP含量。高NFC底物條件下,添加YC能顯著提高發酵3h瘤胃液的NH3-N含量,顯著降低發酵6~24h瘤胃液的NH3-N含量,這可能是由于本試驗所選底物為半純合底物,其在體外發酵剛開始時被瘤胃微生物快速利用而導致瘤胃發酵液在發酵3h時NH3-N含量升高,在發酵進行的6~24h中YC能夠促進瘤胃微生物對NH3-N的利用,進而導致發酵液中NH3-N含量降低,這與劉相玉等的研究結果一致。有研究表明,高NFC底物條件下,添加YC能夠促進NH3-N的吸收和轉化,進而降低瘤胃發酵液中NH3-N含量,提高MCP的含量。本試驗中,高NFC底物條件下,添加YC能夠顯著降低發酵3h瘤胃液中MCP含量,顯著提高發酵6~12h瘤胃液的MCP含量,這與NH3-N含量的變化趨勢一致,這說明在高NFC底物條件下,添加YC能夠促進瘤胃微生物的生長。

因此,在高NFC底物條件下模擬SARA,添加YC能夠通過降低發酵液中乳酸含量達到調控瘤胃發酵液pH的效果,促進瘤胃微生物對氨氮的利用于瘤胃微生物的生長,具有緩解SARA的潛力。但大量研究表明,YC在體內外對瘤胃發酵指標的影響作用具有一定差異,且YC的作用效果受多種因素(酵母菌種類、活性、添加劑量、飼糧種類)的影響。因此,未來需通過體內試驗進一步來驗證YC對SARA的緩解作用,還需應用現代科技手段篩選出更高效持久的緩解SARA的酵母產品。

4結論

①當NFC/NDF為2.30時,可成功建立體外SARA模型。

②在高NFC底物條件下,添加YC能夠穩定瘤胃液pH,提高TVFA含量,降低乳酸含量,具有緩解SARA的潛力,其中以添加底物干重的2.0%的YC對SARA的緩解作用最佳。

③添加YC對常規底物的作用效果不明顯,以添加底物干重的1.5%的YC的改善作用效果最佳。

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