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導讀

大豆是亞洲地區重要的糧油作物之一。隨著豆制品加工技術的成熟和消費需求的增長，作為豆漿、豆腐或其他大豆產品生產中所產生的主要副產品，豆渣除小部分作為牲畜飼料外，大部分被當成工業廢料丟棄。然而，豆渣含有豐富的膳食纖維、蛋白質、脂肪、異黃酮和維生素等，具有豐富的營養價值。目前，世界上越來越多的國家將豆渣看作是一種新的保健食品源，在我國豆渣資源尚未被充分利用。

固態發酵技術是一種經濟方便的發酵技術，被廣泛地應用于食品生產和加工過程中。微生物在發酵過程中所產生的復雜酶系和眾多活性物質，可以提高豆渣的營養價值、改善口感、提高產品的生物活性。近幾年來，使用豆渣進行固態發酵生產一些具有生物活性的化合物的研究日益增多，李紅艷等報道豆渣經粗壯脈紋孢菌發酵，類胡蘿卜素含量大大增加。Zhu Yunping等利用枯草桿菌（Bacillus subtilisB2）固態發酵，可以得到一種叫做1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）的物質，DNJ是一種糖苷酶抑制劑，可以用于糖尿病患者。還有研究表明，可以利用青霉菌發酵豆渣得到新型殺蟲劑。但國內將豆渣直接應用開發為功能性食品的研究以及對發酵豆渣食品特性的研究較少。

在國外，Kronenberg、Matuso等對微生物發酵豆渣的營養成分及食品特性進行了研究，而均未對發酵豆渣的抗氧化功能特性進行深入研究。為此本實驗以傳統固態發酵工藝為基礎，研究了米根霉及少孢根霉兩株霉菌在豆渣發酵過程的情況，對發酵過程中主要營養成分及抗氧化活性進行測定，與未發酵的豆渣進行對比，為開發利用豆渣制成的功能性食品提供理論參考。

1.1 材料、菌株與試劑

大豆購買于江蘇省南京市蘇果超市。少孢根霉（Rhizopus oligosporus RT-3）、米根霉（Rhizopus oryzae）均由南京農業大學食品微生物實驗室保存。

2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、菲洛嗪、水溶性VE（Trolox） 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic aciddisodium salt，EDTA-2Na）、氯化鐵、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

TM2300全自動凱氏定氮儀丹麥Foss公司；微波消解儀意大利Milestone公司；索式脂肪抽提裝置上海華瑞儀器有限公司；SX2-4-13數顯控溫馬弗爐上海蘇凈實業有限公司；LHS-150SC恒溫恒濕箱上海一恒科技有限公司；AUY-120分析天平、UV-2450紫外分光光度計日本Shimadzu公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；酶標儀 美國Bio-Tek公司；64RL高速冷凍離心機美國Beckeman公司；電熱恒溫鼓風干燥箱上海益恒實驗儀器有限公司；手提式不銹鋼蒸汽消毒器上海三申醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵豆渣的制備

稱取大豆1 000 g，加入3 000 mL蒸餾水，室溫條件下浸泡12 h。以1∶7（m/V）的豆水比進行磨漿，制得含水量85%的新鮮豆渣。將新鮮豆渣烘至含水量為60%后放在121 ℃的高壓滅菌鍋內滅菌15 min。在其中一份豆渣中按1 g/100 mL的接種量接種米根霉的孢子懸浮液（108～109個/mL），另一份豆渣中按同樣的接種量接種少孢根霉的孢子懸浮液（108～109個/mL）。混勻后裝入保鮮袋中并鋪平。鋪平后的豆渣約占保鮮袋面積的1/2，厚度約3 cm，每隔2 cm扎小孔透氣后，置于30 ℃培養箱中發酵30 h。每隔6 h取樣，將取出的樣品冷凍并經粉碎機粉碎，過80 目篩備用。

1.3.2 發酵豆渣理化指標測定

1.3.2.1 膳食纖維含量的測定

參照GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纖維的測定》。

1.3.2.2 粗蛋白含量的測定

參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》。

1.3.2.3 粗脂肪含量的測定

參照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》。

1.3.2.4 灰分含量的測定

參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》。

1.3.2.5 還原糖含量的測定

1 g凍干樣品置于25 mL 蒸餾水中，50 ℃水浴搖床提取30 min，4 ℃、8 000×g離心15 min，取上清液定容至100 mL待測。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定樣品還原糖含量。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。結果以葡萄糖當量表示（mg/g，以豆渣凍干粉計）。

1.3.2.6 可溶性蛋白含量的測定

1 g凍干樣品置于25 mL pH 9.0 硼酸-氫氧化鈉緩沖液，室溫條件下超聲輔助提取1 h，4 ℃、8 000×g離心15 min，取上清液定容至25 mL待測。采用考馬斯亮藍法測定樣品中的可溶性蛋白含量。以牛血清白蛋白質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。結果以牛血清白蛋白當量表示（mg BSA/g，以豆渣凍干粉計）。

1.3.2.7 纖維素酶活力測定

1 g凍干樣品置于20 mL 0.1 mol/L pH 4.8的乙酸鈉緩沖溶液中，磁力攪拌30 min，4 ℃、8 000×g離心15 min，上清液則為粗酶液。纖維素酶活力的測定采用文獻報道的方法。

酶活力單位（U）定義：50 ℃、pH 4.8時每分鐘水解生成1 μg葡萄糖所需要的酶量。

1.3.2.8 糖化酶活力測定

粗酶液制備方法同1.3.2.7節。糖化酶活力的測定采用文獻報道的方法。

酶活力單位（U）定義：30 ℃、pH 4.8時每分鐘水解生成1 mg葡萄糖所需要的酶量。

1.3.2.9 蛋白酶活力測定

以1∶20的料液比于蒸餾水中室溫條件下提取1 h，4 ℃、8 000×g離心15 min，上清液則為粗酶液。參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中關于蛋白酶活力測定的方法測定樣品中的蛋白酶活力。

酶活力單位（U）定義：40 ℃，pH 7.5時每分鐘從可溶性酪蛋白中水解生成1 μg酪氨酸所需要的酶量。

1.3.3 發酵豆渣抗氧化活性的測定

1.3.3.1 水溶性提取物的制備

1 g凍干樣品置于25 mL蒸餾水，50 ℃水浴搖床提取4 h，8 000×g離心15 min，定容至25 mL，上清液以0.45 μm膜過濾，即為發酵豆渣水溶性提取物。

1.3.3.2 還原力測定

還原力的測定采用文獻報道的方法。先后在200 μL樣品溶液中加入1 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和1 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液。混勻，50 ℃水浴20 min，取出后流水迅速冷卻，再加入1 mL 10 g/100 mL三氯乙酸。取1 mL上清液加入200 μL 1 mg/mL氯化鐵溶液。10 min后于700 nm波長處測吸光度。以Trolox質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。結果以Trolox的當量表示（μg Trolox/g，以豆渣凍干粉計）。

1.3.3.3 清除ABTS＋•活性測定

清除ABTS＋·能力的測定按照文獻報道的方法。10 mL的7 mmol/LABTS儲備液與20 mL 2.45 mmol/LK2S2O8溶液混合后，室溫下暗反應16 h，形成ABTS＋•。使用前用0.01 mol/L磷酸緩沖液稀釋至734 nm波長處吸光度為0.70±0.05時，作為本實驗的ABTS工作液。測定時，取1 mL樣品溶液與4 mL ABTS＋•工作液混合，室溫條件下靜置反應6 min后，迅速測定其在734 nm波長處的吸光度。以Trolox質量濃度為橫坐標，ABTS＋•清除率為縱坐標，繪制標準曲線。結果以Trolox的當量表示（μgTrolox/g，以豆渣凍干粉計）。

1.3.3.4 金屬離子螯合能力測定

金屬離子螯合能力的測定按照文獻報道的方法。先后加入0.50 mL樣品溶液、0.75 mL蒸餾水、2 mmol/L氯化亞鐵溶液，混勻后加入0.10 mL 5 mmol/L菲啰嗪室溫反應20 min，測定562 nm波長處吸光度。以EDTA-2Na質量濃度為橫坐標，金屬離子螯合率為縱坐標，繪制標準曲線。結果以EDTA-2Na的當量表示（μg EDTA-2Na/g，以豆渣凍干粉計）。

1.4 數據處理與分析

實驗數據均為3 次重復實驗所得的平均值，結果表示為±s。采用SPSS 16.0軟件進行顯著性和相關性分析，采用Origin 8.5軟件作圖。

2結果和分析

2.1 發酵豆渣的一般化學成分分析

對未發酵豆渣及由米根霉、少孢根霉發酵的豆渣冷凍干燥后，進行粗蛋白、粗脂肪、灰分、膳食纖維含量的測定（表1）。未發酵的豆渣蛋白質含量為31.76%，經過米根霉、少孢根霉發酵后，蛋白質含量分別提高至33.81%、34.47%。同時粗脂肪、灰分的含量也有所提高。一方面由于伴隨著微生物的生長，霉菌菌絲覆蓋整個豆渣表面，霉菌菌絲與豆渣基質合二為一，菌絲中的粗蛋白、粗脂肪、灰分均能夠引起發酵豆渣中相應含量的提高。另一方面發酵過程中隨著微生物生長，豆渣中的部分物質被微生物當做碳源利用，導致其他營養成分的比例發生改變，從而導致發酵后其化學成分的含量發生改變。如微生物在發酵過程中將豆渣中的某些營養物質降解為一些小分子物質，如醇和酸發生酯化反應，形成酯類物質，從而使得乙醚提取物增加，導致粗脂肪含量明顯增加（P＜0.05）。豆渣中總膳食纖維含量很高，占豆渣干質量的54.67%，其中主要成分是不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF），含量為47.13%，而可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）含量相對較低，只有7.54%。發酵后，IDF含量有所下降，SDF的含量有所上升，同時IDF和SDF的比值顯著下降（P＜0.05）。發酵前IDF/SDF為6.25，經過米根霉、少孢根霉發酵后IDF/SDF分別降低到4.06、3.51，這表明發酵過程中，微生物會產生少量的纖維素酶，將一部分IDF水解成SDF，從而造成IDF/SDF值的變化。

2.2 還原糖含量變化

由圖1可知，豆渣中的還原糖隨著發酵時間的延長而增加，其中在12～24 h期間顯著增加（P＜0.05），經米根霉、少孢根霉發酵30 h后豆渣還原糖含量分別為30.47、34.28 mg/g，比未發酵豆渣分別提高了7.31、8.22 倍。由于在發酵過程中微生物所分泌的纖維素酶及淀粉酶的作用，可將豆渣中的纖維素、淀粉等降解為低分子的還原糖，從而使豆渣中還原糖的含量隨著發酵時間的延長而增加。

2.3 可溶性蛋白含量變化

由圖2可知，隨著發酵時間的延長，豆渣的可溶性蛋白質含量在0～24 h顯著增加（P＜0.5），之后稍有下降。少孢根霉發酵豆渣的可溶性蛋白質含量由發酵前的4.17 mg BSA /g增加至9.44 mg BSA /g，米根霉發酵豆渣的略低于同時間內少孢根霉發酵豆渣，為8.99 mg BSA/g。由于在微生物的發酵過程中，豆渣中的蛋白質被分解成多肽和一些有一定空間結構但分子質量較小的蛋白質，增加了其蛋白質的溶解性，所以可溶性蛋白質的含量會增加。Sun Hong等采用枯草芽孢桿菌對棉籽粉進行發酵，也發現發酵后的棉籽粉中可溶性蛋白質增多。進一步延長發酵時間，豆渣中的蛋白質更多的被降解成氨基酸和分子質量更小的小肽物質，而考馬斯亮藍法更多是反映大分子可溶性蛋白質變化的情況，無法準確測定其中的氨基酸和小肽，從而造成后期可溶性蛋白質呈現下降趨勢。

2.4 纖維素酶活力變化

由圖3可知，發酵后的豆渣中纖維素酶活力較未發酵的豆渣有顯著提高（P＜0.05）。發酵30 h后，經米根霉、少孢根霉發酵的豆渣中纖維素酶活力分別達到1 989.42、2 165.73 U/g，比未發酵豆渣分別提高了1.62、1.77 倍。纖維素酶活力的變化影響豆渣中膳食纖維的含量。微生物在發酵過程中所產生的纖維素酶將水不溶性膳食纖維多糖水解，從而使水溶性膳食纖維多糖成分增加。另一方面水不溶性膳食纖維的大大減少導致總膳食纖維含量的降低。霉菌發酵可適當提高豆渣可溶性膳食纖維含量，使得豆渣的抗氧化、抗血壓等功能活性提高。

2.5 糖化酶活力變化

由圖4可知，未發酵豆渣中糖化酶活力較低，僅為4.90 U/g，經米根霉、少孢根霉發酵后，其糖化酶活力與未發酵的豆渣相比得到顯著提高（P＜0.05）。米根霉、少孢根霉發酵的豆渣糖化酶活力均在發酵24 h達到最大，最高值分別為34.25、36.09 U/g。微生物可以在發酵過程中分泌產生糖化酶，將豆渣中的碳水化合物糖化，進而提高微生物生長所需要的碳源。繼續培養，糖化酶活力均稍有下降，此時霉菌生長已經處于停滯期，抑制糖化酶活力，從而導致酶活力下降。糖化酶活力的變化與還原糖變化規律基本一致。

2.6 蛋白酶活力變化

由圖5可知，豆渣在初始發酵的12 h內，蛋白酶活力變化不明顯，可能是因為在0～12 h霉菌孢子處于萌發狀態。12 h后，隨著發酵時間的延長，微生物生長迅速，代謝也逐漸旺盛，蛋白酶活力不斷提高。在24 h經米根霉、少孢根霉發酵的豆渣中蛋白酶活力分別達到796.68、906.47 U/g。但是，隨著發酵時間的進一步延長，微生物分解蛋白質的能力減弱，從而導致蛋白酶活力變化趨于穩定。微生物在發酵過程中所產生的蛋白酶會使得豆渣中的功能性小肽和氨基酸得到部分積累，從而改善豆渣的功能活性。

2.7 發酵豆渣的抗氧化能力

由于不同的自由基和損傷劑會導致不同的氧化損傷，因此單一的抗氧化體系很難全面體現其生物學意義，需要相互補充的多種體系來評價樣品在不同體系中的真實效應。本研究采用還原能力、ABTS＋·清除能力以及金屬離子螯合能力3 種不同的抗氧化能力評價指標，試圖從多個側面反映豆渣在發酵過程中抗氧化能力的變化。

2.7.1 還原力變化

由圖6可知，對于少孢根霉和米根霉兩株菌而言，其還原力均隨著發酵時間的延長而明顯增強。且兩株菌的還原力均在發酵24 h時達到最大值，分別為677.70、588.24 μg Trolox/g。Yang等認為在發酵過程中產生了一些還原酮類物質，這些物質可通過提供電子使自由基變為穩定的物質，以中斷自由基鏈式反應，從而導致發酵后的樣品具有較強的還原能力。除此之外，蛋白質的水解產物如小肽物質和氨基酸，如亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、組氨酸和色氨酸也能使發酵后的樣品具有較強的還原能力。隨著發酵的進行，微生物所分泌的各種酶類物質，如纖維素酶、蛋白酶、糖化酶的產生，使發酵后的樣品產生更多的還原糖、小肽和氨基酸等物質，這些都與發酵后樣品還原能力的提高有關。

2.7.2 ABTS＋·清除活性

如圖7所示，米根霉、少孢根霉在發酵0～18 h時，豆渣的ABTS＋·清除活性均隨著發酵時間的延長顯著上升，在18 h分別達到3 803.34、4 546.31 μg Trolox/g，相比于未發酵的豆渣分別提高了1.36、1.63 倍。少孢根霉發酵豆渣的ABTS＋·清除活性在18 h后趨于穩定，而米根霉發酵豆渣的在18 h后隨著發酵時間的延長仍有小幅度提高。在30 h時，其ABTS＋·清除活性為4 298.66 μg Trolox/g。ABTS＋·清除能力的不同表明發酵產物的抗氧化性與其抗氧化物的種類和含量有關。不同微生物有不同的發酵特性，因此在發酵過程中，發酵產物的種類、比例以及含量都會隨著發酵時間的進行而變化，因此捕獲自由基的能力可能有變化。

2.7.3 金屬離子螯合能力

如圖8所示，米根霉和少孢根霉發酵24 h后其水提取物對于Fe2＋螯合能力比未發酵豆渣有明顯提高，螯合能力分別為3 296.88、3 709.16 μg EDTA-2Na/g，此后隨著發酵時間的延長稍有降低。已有報道顯示許多傳統發酵食品，如koji、kinema在發酵后均能提高其對金屬離子的螯合能力。Pownall等指出一些功能性小肽由于其特殊的肽鏈結構及側鏈氨基酸，可以阻斷自由基的鏈式反應，對于螯合過渡態的金屬離子起著重要的作用。

3討論

用米根霉、少孢根霉為發酵菌株，以鮮豆渣為原料，純種發酵制備發酵豆渣。發現在發酵過程中，隨著發酵時間的延長會引起發酵基質產生大量的生物化學變化，主要體現在還原糖含量、可溶性蛋白質含量、纖維素酶活力、糖化酶活力和蛋白酶活力都隨著發酵時間的延長顯著增加，也說明了在發酵過程中米根霉和少孢根霉能夠在豆渣中較好的生長，將許多大分子物質有效分解為易被吸收利用的小分子物質，為微生物的后期發酵提供充足的碳源、氮源。兩種菌株發酵制得的豆渣其各自的水提取物都表現出較強的還原能力、ABTS＋·清除能力、Fe2＋螯合能力，說明發酵豆渣與未發酵豆渣相比，具有更強的抗氧化活性，可以作為氫供體、自由基清除劑以及過氧化金屬離子的螯合劑，為豆渣的功能性食品開發提供了可能性。